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文章导读

重组蛋白类生物制品，包括重组亚单位疫苗、VLP疫苗、多肽类激素、细胞因子、生长因子、酶制剂、抗体片段、纳米抗体等，其工业化发展进程与表达宿主的研发和优化息息相关。自20世纪90年代，大肠杆菌的完整基因组序列完成分析，随后经不断的改造，逐步发展为最常见的重组蛋白生产用宿主，全球首款重组胰岛素Humulin即通过大肠杆菌生产制备。

关于重组蛋白的异源表达，主要考虑4种因素：宿主菌、质粒载体、诱导方式和重组蛋白特性（毒性和可溶性等），其中宿主菌是重要的影响因素，与蛋白特性、启动子类型和质粒载体紧密相关。

为传递大肠杆菌（E.coli）表达体系相关的实用技术，菌菌查询了多篇论文及商业化网站，整理了现有的大肠杆菌宿主菌，包括一般蛋白表达、毒性蛋白表达、促进蛋白可溶性、适合稀有密码子和内毒素缺陷的宿主菌，并汇总了不同宿主菌的基因型、启动子类型、适用的质粒种类，以便于大家深入了解并合理运用大肠杆菌表达系统。

今天的文章作为开篇，菌菌分享下基于大肠杆菌表达的产品类型，以具化大肠杆菌生产平台的市场需求，同时汇总了商业化宿主菌改造策略，以及适用于一般蛋白表达的大肠杆菌宿主：BL21、BL21(DE3)和BL21Star(DE3)。后续菌菌将继续更新适用于毒性蛋白表达、促进蛋白可溶性、适合稀有密码子和内毒素缺陷的宿主菌，敬请关注~

一 基于大肠杆菌表达体系的重组蛋白品类

大肠杆菌，也称大肠埃希氏菌（E.coli, Escherichia coli），其作为表达宿主的优势是遗传背景清晰、生产成本较低，不足之处是无翻译后修饰功能，不适用于表达复杂蛋白。生物领域同行们结合其优劣势，使用大肠杆菌生产了多品类的预防性疫苗、治疗性重组蛋白、治疗性酶、医美原料、科研用酶和工业用酶。据菌菌统计，基于大肠杆菌表达体系的产品包括：

（1）预防性疫苗：VLP疫苗、重组亚单位疫苗；已上市品种包括美国FDA获批上市的脑膜炎球菌疫苗（辉瑞Pfizer）、国内NMPA获批上市的二价HPV疫苗（万泰生物）。

（2）治疗性蛋白：重组多肽、细胞因子、生长因子、抗体片段、纳米抗体；已上市品种包括胰岛素、GLP-1类似物利拉鲁肽、阿地白介素、干扰素、(硫培)非格司亭、重组碱性成纤维细胞生长因子、雷珠单抗、全球首款纳米抗体CABLIVI。

（3）治疗性酶：CRISPR/Cas9基因编辑酶、尿酸氧化酶；已上市品种包括Pegloticase。

（4）医美原料：胶原蛋白、肉毒素。

（5）科研用酶：限制性内切酶、T7 RNA聚合酶、DNA连接酶等。

（6）工业用酶：淀粉酶、蔗糖酶、纤维素酶、木聚糖酶等。

二 通用大肠杆菌改造策略

自获得大肠杆菌完整基因组序列后，研究人员针对大肠杆菌进行了多重改造，形成了不同的基因型（genotype），满足工业生产中菌体生长、维持外源DNA和外源蛋白稳定性或表达毒性蛋白等特定目的。大肠杆菌宿主菌改造策略包括：

①限制/甲基化缺陷：具有失活的限制/甲基化系统，避免外源DNA的降解；

②蛋白酶缺陷型：Lon、ompT等蛋白酶编码基因缺陷，减少外源蛋白的降解；

③RNase E缺陷：RNase E表达缺陷，可增强mRNA稳定性，提高外源蛋白表达量；

④λ噬菌体DE3溶原：含T7 RNA聚合酶基因，适配基于T7启动子的质粒载体；

⑤控制本底表达水平：基于阿拉伯糖严格调控T7启动子，或引入T7噬菌体溶菌酶编码基因；

⑥促进蛋白可溶性：硫氧还蛋白还原酶trxB和谷胱甘肽还原酶gor突变，促进细胞质中二硫键的形成；

⑦稀有密码子补给：引入大肠杆菌稀有密码子tRNA，适合表达真核来源的蛋白；

⑧内毒素缺陷型：不含内毒素，减轻下游纯化压力。

三 用于一般蛋白表达的宿主菌

今天分享的三种大肠杆菌宿主菌，也是重组蛋白表达较为常见的菌株：BL21、BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)，菌菌将围绕菌株基因型、适用启动子类型、质粒载体类型展开阐述。

（1）大肠杆菌BL21

大肠杆菌BL21的基因型为B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]κ-12(λS)，各个基因型简析如下：

B：代表B系菌种；B系大肠杆菌属于lon- dcm-基因型，lon突变导致ATP依赖性蛋白酶Lon缺失，减少重组蛋白的降解，提高重组蛋白产量。dcm突变使胞嘧啶甲基化酶失活（CCWGG），用于制备特定位点未甲基化的DNA，使用甲基化敏感的限制性酶进行酶切时需格外注意。

F-：不含F致育因子。

dcm：如上，B系菌株均带有dcm基因型。

ompT：ompT基因突变导致外膜蛋白酶VII缺陷，减少重组外源蛋白的降解，可提高目的蛋白的表达量。

hsdS(rB- mB-)：菌株具有失活的原生限制/甲基化系统，避免外源DNA的降解。

gal：菌株不能直接利用半乳糖。

[malB+]κ-12(λS)：malB区域来源于E.coli K-12（K系菌株）。

适用质粒：大肠杆菌BL21表达大肠杆菌RNA聚合酶，适合依赖于大肠杆菌RNA聚合酶的质粒载体，如pGEX、pMAL等。小伙伴们要注意了，BL21菌株不表达T7 RNA聚合酶，不适合T7启动子；常用的原核表达载体pET系列是T7启动子，不能与BL21菌株配套使用。

（2）大肠杆菌BL21(DE3)

大肠杆菌BL21(DE3)基因型为B F- OmpT hsdS B (rB- mB-) gal dcm [malB+]κ-12(λS) (DE3)，是被λ噬菌体DE3溶原化获得的BL21衍生菌株，DE3区域包括由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因与lac阻遏蛋白过表达突变基因，通过IPTG诱导目的蛋白表达。

适用质粒：大肠杆菌BL21(DE3)基于T7启动子和非T7启动子的质粒载体，包括pET系列、pGEX和pMAL。

大肠杆菌BL21(DE3)是一般蛋白表达的常用宿主，存在一定的本底表达，因此不适用于毒性蛋白的表达。

（3）大肠杆菌BL21 Star(DE3)

大肠杆菌BL21 Star(DE3)基因型为B F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm rne131 (DE3)，增加了rne131突变（RNase E编码基因），导致RNase E表达缺陷，可以增强mRNA稳定性，提高外源蛋白表达量。

适用质粒：大肠杆菌BL21 Star(DE3)适用基于T7启动子和非T7启动子的质粒载体，包括pET系列、pGEX和pMAL。

大肠杆菌BL21 Star(DE3)用于一般蛋白的表达，不建议表达毒性蛋白。

四 结语

如上所述，三种大肠杆菌宿主BL21、BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)，均采用了限制/甲基化缺陷、蛋白酶缺陷的改造策略，以维持外源DNA和外源蛋白的稳定。BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)属于λ噬菌体DE3溶原菌株，包含了T7 RNA聚合酶编码基因，以适配基于T7启动子的质粒载体。BL21 Star(DE3)增加了RNase E表达缺陷的表型，增强mRNA的稳定性，进一步提高重组蛋白的表达量。

今天菌菌分享的三种大肠杆菌宿主：BL21、BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)，均未针对重组蛋白的本底表达做严格控制，存在一定的基础表达水平，目标蛋白为毒性蛋白时可能会导致菌体裂解，因此不建议用于毒性蛋白的表达。

内容如有遗漏或有误还请大家指正，期待与大家共同探讨。

文章预告：下篇文章菌菌继续分享适用于毒性蛋白的表达宿主，聊一聊研究者们如何控制宿主菌的本底表达，敬请关注~

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