为了去除细胞壁中的纤维素和果胶，可以采用以下两种酶作为候选：

①纤维素酶（Cellulase）

纤维素是由葡萄糖脱水合成的大分子多糖，而纤维素酶是由一系列酶组成的一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成，具备将纤维素从大分子多糖水解为单分子葡萄糖的能力。此外，纤维素酶还具备很高的木聚糖酶活性，有助于进一步酶解初生细胞壁和次生细胞壁的半纤维素。纤维素酶的活性在pH4.5-6.5时达到最大，Mg2+对酶活性有激活作用，容易受到植物细胞的酚类化合物的活性抑制。

②果胶酶（pectinase）

果胶是以聚半乳糖醛酸为主的杂多糖。相应的，果胶酶也是由多种酶混合而成的混合酶，主要包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶，可将果胶水解为半乳糖醛酸，以此破坏细胞壁。果胶酶的活性在pH3.0时达到最大，Ca2+对酶活性有激活作用，Fe3+和Cu2+对酶活性有抑制作用。

一般情况下，单一的纤维素酶或果胶酶对细胞壁的水解能力并不强。所以，这两种酶通常是以终浓度1.5%纤维素酶和0.1%果胶酶混合进行。10X官方的protocol则是直接使用含有这两种酶的混合酶——崩溃酶（Driselase）以2%的终浓度进行细胞壁的酶解。

缓冲液选择

缓冲液是整个单细胞悬液制备过程中植物组织和细胞存在的液体环境，也是在GEM中会与反应液直接混合的液体。所以，在缓冲液的配置上，我们需要综合考虑缓冲液对细胞的保护性和缓冲液对酶活性的激活能力。

（1）缓冲液应该保持和植物细胞一样的渗透压，维持偏中性的pH环境，排除会引起植物细胞产生剧烈转录本变化的物质。

例如，在缓冲液中要尽量排除蔗糖的存在，因为蔗糖会被植物细胞感知并引起调节能量相关信号传递过程的基因转录，这会导致后续数据分析产生假阳性的通路富集。所以，我们通常选择影响较小并可维持溶液渗透压的甘露醇作为主要溶质。除此以外，浓度0.1%的牛血清白蛋白（BSA）也可以有效维持细胞活性。

（2）保持高的酶活性，可以缩短酶解时间，减小酶解对组织的损害。

缓冲液对酶活性的提升可从两方面进行：一是增加金属离子，激活酶活性；二是增加表面活性剂，增强酶活性。但是，这两种物质都应该只存在于酶解缓冲液中。Ca2+会引起细胞粘连，造成一个GEM中存在多个细胞。同时，Ca2+也有可能引起反转录反应液的结晶，降低反转录效率。表面活性剂则或多或少会对细胞膜造成损伤，所以应该 尽量选择温和的表面活性剂，例如2-(N-吗啉)乙磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic Acid，MES）。

综合以上两点，我们可以使用的酶解缓冲液的配方为：100mM KCl，20mM MgCl₂，20mM CaCl₂，0.1%（w/v）BSA，80mM MES，0.6M 甘露醇，使用0.1M Tris HCl调pH至5.5。

洗涤缓冲液/原生质体缓冲液的配方为：100mM KCl，20mM MgCl2， 0.1%（w/v）BSA，0.4M 甘露醇。

返回搜狐，查看更多