缺血性脑卒中临床常用的治疗手段是血管内溶栓[1]，但是脑组织恢复血流灌注后常发生缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤。脑IR损伤可以导致细胞水肿、坏死，其发病机制复杂，包括自由基增多、炎症反应、钙超载、自噬等[2]。AMPK是以上机制的交叉口，可被多种因素激活，活化的AMPK可启动AMPK/mTOR/ULK1信号通路，从而激活细胞自噬[3]。多项研究表明补阳还五汤可通过调控自噬发挥抗脑IR损伤作用[4-7]，但对于补阳还五汤是否可通过AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路发挥神经保护作用尚未见相关报道。本课题组经离体实验表明，补阳还五汤可通过该自噬信号通路减轻大鼠原代神经元缺氧缺糖/复氧复糖损伤；本研究基于AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路，探讨补阳还五汤抗大鼠脑IR损伤的机制。

48只SPF级SD大鼠，♂，体质量(250-280) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0006)，饲养时温度、湿度适宜，适应性饲养7 d，自由摄食、饮水。

补阳还五汤内含黄芪120 g，赤芍5 g，当归6 g，红花、桃仁、川芎、地龙各3 g，水煎剂浓缩至100 mL，浓度1.43 mg·L-1(药材购自河北乐仁堂药业有限公司)；AMPK激动剂Metformin(HY-17471A)购自MCE公司；抗体AMPKa(#2532)、mTOR(#2972)、p-AMPKa(#2535)、p-mTOR(#5536)、p-ULK1(#14202)均购自CST；ULK1抗体(SAB2109080-100uL)、LC3B抗体(L7543-100 uL)均购自Sigma；β-actin抗体(GB11001)、二抗(GB23303)购自赛维尔；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(购自Beyotime)；PVDF膜(孔径0.45 μm和0.2 μm)购自美国Millipore公司；TUNEL试剂盒购自promega。多功能成像系统(Fusion FX5 Spectra)购自法国Vilber公司；leica显微镜拍照系统、正置荧光显微镜(DM5000B)均购自德国Leica公司。

将大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血/再灌注模型组(Model)、补阳还五汤组(BYHWD)、补阳还五汤+AMPK激动剂Metformin组(BYHWD+Met)。BYHWD和BYHWD+Met组大鼠术后24 h内予以补阳还五汤14.3 g·kg-1灌胃，BYHWD+Met组大鼠于线栓插入后即刻予Metformin 10 mg·kg-1腹腔注射，Sham和Model组大鼠予以等体积蒸馏水灌胃，连续应用3 d，神经功能评分完成后处死大鼠取材。

采用改良的线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)模型。应用1%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射(用量50 mg·kg-1)，将麻醉后的大鼠采用仰卧位固定于手术操作台上。对手术区域进行常规消毒，于大鼠颈部正中偏左侧行纵向切口，逐层对暴露的组织和血管进行钝性分离，并将两侧的组织利用拉钩进行固定扩大手术视野，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，于颈外动脉远心端剪一“V”型切口，经此斜口插入线栓沿颈内动脉到达大脑前动脉起始端，入栓长度19 mm左右遇阻力则停止。2 h后拔出线栓，再灌注72 h后处死大鼠取材。Sham组仅分离血管，不插线栓。

缺血/再灌注d 3参照Zea longa评分法对各组大鼠的神经功能缺失情况进行盲评。具体标准为：0分：无神经损伤症状；1分：悬尾实验不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：无自主活动或陷入深度昏迷中。得分越高表明神经功能损伤越重。

再灌注72 h后，麻醉大鼠进行取脑，将其置于脑槽内并于-20 ℃中冻存15 min，取出后行2 mm厚度的冠状面切片，将各切片移至培养皿中加入TTC染液，放置在37 ℃恒温箱中避光孵育20 min，每10 min翻动1次。完成染色后，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃过夜后拍照。用Image Pro Plus 6.01图像分析软件进行统计，检测大鼠脑梗死体积。

将大鼠灌流取脑后制备石蜡切片，石蜡切片常规脱蜡(分别二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min)，乙醇脱水(浓度梯度分别100%、95%、90%、80%、70%各5 min)；蒸馏水冲洗3次，每次5 min；用甲苯胺蓝染液浸染组织，后用蒸馏水洗净染料，再依次置于70%、80%、95%和100%乙醇中脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。正置显微镜下观察拍照，观察神经细胞形态，计数神经细胞数量。

将大鼠灌流取脑后制备冰冻切片，冰冻切片置于4%多聚甲醛固定30 min，于PBS(pH 7.4)中清洗5 min，共3次；应用蛋白酶K工作液(原液∶ PBS=1 ∶ 9)修复22 min，洗涤、破膜，加入buffer常温孵育10 min；按照TUNEL试剂盒说明配置反应液覆盖组织，37 ℃恒温孵育2 h，后续进行DAPI复染细胞核、封片，应用荧光显微镜观察并拍照，观察神经细胞凋亡率。

取适量大鼠脑组织加入RIPA蛋白裂解液，经过研磨、离心、取上清、蛋白变性等步骤制备蛋白样。制备SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳分离，用湿法将目的蛋白转移至PVDF膜上。室温下用质量分数为5%BSA进行膜封闭2 h，孵育一抗并置于4 ℃过夜。次日洗膜，二抗孵育1 h，再次洗膜，最后显影成像，Image Lab软件(Bio-Rad)对结果进行灰度分析。

实验数据均以x±s表示，使用SPSS 19.0软件进行统计分析。组间实验数据进行单因素方差分析。使用GraphPad Prism 5.01软件作图。

Fig 1所示，Sham组大鼠无神经功能损伤，结果为0分。Model组较Sham组评分增加(P < 0.05)；BYHWD组较Sham组评分下降(P < 0.05)，BYHWD+Met组则评分较BYHWD组增加(P < 0.05)。

Fig 2A所示为脑梗死情况，左侧大脑缺血明显则可见白色梗死区，无损伤则大脑为鲜红色。Sham组未见梗死区，对比Sham组，Model组、BYHWD组和BYHWD+Met组左侧大脑缺血明显，可见白色梗死区。如Fig 2B所示，与Model组相比，BYHWD组大鼠脑梗死体积比率明显下降，差异具有显著性(P < 0.05)。AMPK激动剂则减弱了补阳还五汤的作用，脑梗死体积有所上升(P < 0.05)。

Fig 3所示，Sham组大鼠皮层细胞形态结构完整，排列紧密，胞质、核仁清晰，有大量的神经细胞存在；与Sham组相比，Model组皮层中细胞数目明显减少(P < 0.05)，细胞排列紊乱，轮廓模糊不清；与Model组比较，BYHWD组皮层中细胞排列较整齐，细胞边界较清晰，完整神经细胞数量较Model组有增加(P < 0.05)；AMPK激动剂削弱补阳还五汤对神经细胞的保护作用(P < 0.05)。

Fig 4所示，对比Sham组，Model组大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡率明显升高，与Model组相比，BYHWD组大鼠神经细胞凋亡率明显降低，差异均具有统计学意义(P < 0.05)；增加AMPK激动剂处理后，补阳还五汤的作用受到拮抗，细胞凋亡率有所增加(P < 0.05)。

Fig 5A展示了补阳还五汤对自噬蛋白LC3表达的影响。与Sham组相比较，Model组大鼠缺血侧脑组织的LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P < 0.05)；与Model组比，BYHWD组LC3Ⅱ/Ⅰ有所下降(P < 0.05)。如Fig 5B所示，与Sham组相比，Model组p-AMPK/AMPK比值明显升高(P < 0.05)，与Model组比较，BYHWD组p-AMPK/AMPK比值下降(P < 0.05)。Fig 5C、D所示与Sham组比较，Model组p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值降低；与Model组相比，BYHWD组p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值明显升高(P < 0.05)；在AMPK激动剂的作用下，使补阳还五汤对上述各项指标的影响下降，并均具有统计学意义(P < 0.05)。

缺血性脑卒中病理机制复杂，针对发病机制的各种神经保护治疗效果不够理想[8]，有效的溶栓治疗受到严格的时间窗限制，探寻中医药的治疗可能是一有效手段。补阳还五汤用于脑卒中治疗历史久远，可发挥补气活血，化瘀通络之功，多项基础和临床研究表明补阳还五汤具备抗脑IR损伤的作用[9-10]。我实验室前期研究也表明补阳还五汤可上调Notch1、Hes1、Hes5的表达，对脑IR损伤大鼠神经干细胞移植后的脑保护功能起到促进作用[11]。赵欣等[5]发现补阳还五汤可通过调节自噬、稳定线粒体功能发挥神经保护作用。

自噬是细胞内的“清道夫”，可对内环境进行监视，及时清除老化的细胞器、损伤蛋白质，脑缺血发生后自噬呈上调趋势[12]。自噬早期可起到保护性作用，24 h应用自噬抑制剂3-MA进行干预会增加神经元死亡率；但是48和72 h后自噬抑制剂的介入可显著保护神经元免于死亡[13]。通过侧脑室注射3-MA可显著抑制模型组LC3Ⅱ的升高，抑制缺血半暗带神经元的迟发性死亡，缩小脑缺血损伤病变范围[14]。Wang等[15]发现葛根素通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬，保护脑IR损伤大鼠神经功能。

当细胞能量充足时，AMPK处于失活状态，mTOR处于活化状态，活化的mTOR对ULK1的Ser757位点进行磷酸化，并防止ULK1的其他位点被AMPK直接激活，自噬受到抑制。在脑IR损伤能量迅速消耗甚至衰竭的情况下，AMPK催化亚基位点Thr172磷酸化激活，抑制mTOR，使ULK1位点Ser757磷酸化受到抑制；并且AMPK直接对ULK1其他位点磷酸化活化，最终解除mTOR的负性调节作用，发挥AMPK的促进作用，启动自噬[16]。

本研究对补阳还五汤介导AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路抗大鼠脑IR损伤机制进行探讨。通过建立大鼠MCAO模型，选择再灌注72 h进行观察。在自噬过程中，LC3的羧基末端脂质修饰即LC3Ⅱ的增加是自噬体形成所需的特征性表现，在本实验中补阳还五汤抑制了LC3Ⅱ的表达，同时AMPK的磷酸化水平降低，活化的mTOR和ULK1 Ser757磷酸化增加，而AMPK激动剂则逆转了补阳还五汤的上述作用，表明补阳还五汤通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬，使大鼠神经功能评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡率下降，缺血侧脑组织病理损伤程度减轻，发挥神经功能保护性作用。