来源：中国市场监管报

发布时间：2021-11-25

　　蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。蛋白质含量测定是实验室的基础性操作，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示。蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数，即可计算该样品的蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作为标准检验方法。《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016）于2016年12月23日发布，2017月6月23 开始正式实施。本次主要解读凯氏定氮法的适用范围、基本原理、操作注意事项和过程质量控制措施建议等。

标准适用范围　　标准规定了食品中蛋白质的测定方法，其中第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的测定。标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质食品的测定。

基本原理　　凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。即向样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样品中碳和氢被氧化成二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。　　样品消化：浓硫酸具有脱水性和氧化性，可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水，蛋白质会分解为氨，然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点，一般情况下，纯硫酸的沸点在340℃左右，但是在添加硫酸钾后，可提高至400℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以作蒸馏时碱性反应的指示剂。另外，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，可适当增加硫酸的量。　　蒸馏：消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出，影响测定结果，水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐，需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来，这个过程中的氢氧化钠一定要过量，过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成，可用奈氏试纸法，NH4+　　或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。　　吸收：加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从而造成损失，故一般不超过40℃。　　滴定：待吸收完全后，用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定，滴定液的浓度直接影响结果的准确性，必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点时液体呈灰色。

操作注意事项　　样品取样：由于食品种类繁多，形态及含氮量不一，因此取样应均匀和具有代表性，取样前将样品充分混匀。要依据资料查阅、标签标识信息、知识常识、预试验等，预估样品中蛋白质的含量，控制样品称样量在合理范围。原则上样品越少，越容易消化，但样品量太少称量的误差会变大。所以要控制称取的样品量使其含氮量在30mg~40mg较为合理；样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失。　　消化过程：消化脂肪或糖含量较高的样品时，易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出，消化时应先消化加热并不断摇动，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；消化开始时，不能用强火，应该慢慢加热，防止暴沸或样品粘附于瓶壁而消解不完全。为此，消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2ml~ 3ml，促使氧化。　　蒸馏过程：在蒸馏前应检查蒸馏装置的密封性，保证蒸馏装置不能漏气，避免因蒸馏装置漏气造成氨逸出，导致蛋白质测量值偏低。蒸馏时，要保证蒸汽均匀、充足，中间不能停止加热或减小火力，防止产生倒吸；为防止水蒸气发生器内液体爆沸，加入几片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径，以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出；冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出。蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面，再蒸1 min后清洗管口，再移开吸收瓶，最后关掉热源，否则可能发生倒吸。氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸测试馏出液是否为碱性。　　操作安全：浓硫酸属强酸且腐蚀性较强，在操作过程中需注意安全，充分做好自我保护措施，佩戴如防毒面具、手套、护目镜等。

过程质量控制措施　　一般情况下，样品消化不完全、装置漏气导致氨的溢出、操作不当、称样量不合理等均会导致蛋白质测定结果偏低。但若有时控制不好，也会导致结果偏高。日常试验中，可从以下几个方面进行过程质量控制：　　空白控制 试验中需要开展随行样品空白试验，并日常收集空白水平。特别要注意的是，在进行样品消化和蒸馏时，若试验了一个含量较高的样品，如奶粉样品，一定注意清洗容器和蒸馏装置，避免出现含量相对较低样品测试时发生交叉污染而导致结果偏高的情况。　　数据积累日常需要收集和积累常见样品中蛋白质常规含量水平，能识别出结果偏高或偏低时的异常。另外，也可通过平行样精密度来进行综合分析。必要情况下可通过采取不同水平取样量来进行结果验证。　　质控手段 可以通过仪器比对、人员比对、留样再测、质控样等方式验证结果的准确性。

□四川省食品检验研究院 余晓琴