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RNA与蛋白相互作用是RNA功能研究的焦点问题之一，也是环状RNA研究者接下来经常会遇到的问题。本文将通过解读有关方法学资料介绍一种RNA-蛋白相互作用的验证实验：电泳迁移率改变（EMSA）实验。主要参考2011年发表在 Methods in Molecular Biology上的一篇方法学文章(Maxwell, 2011) 。
电泳迁移率改变实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是常用的研究核酸-蛋白相互作用的技术，基本原理是如果核酸分子与蛋白存在相互作用，电泳中会因为两者结合而导致电泳速度变慢，通过杂交实验可以看出具体的变化状态。该实验的操作相对简单，还能进行定量分析，是研究RNA-蛋白相互作用非常有用的技术。 材料与试剂： 常规材料： 重蒸酚（Tris-HCl, pH 8.0）； 氯仿：异戊醇（24:1）； RNase-Free超纯水； 3M乙酸钠（pH 5.2）； 无水乙醇； 70%乙醇 放射标记RNA制备用试剂材料： 小牛肠磷酸酶（CIP）及10×CIP buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM MgCl2, 10 mM ZnCl2, 0.1 M spermidine-HCl 多核苷酸激酶（PNK）及10×PNK buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 70 mM MgCl2, 50 mM 二硫苏糖醇(DTT) [γ-32P] 标记ATP G-25 sephadex 凝胶珠与离心柱 (Amersham Pharmacia) TE buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA. 丙烯酰胺母液：acrylamide：bisacrylamide=19:1 10×TBE：0.89 M Tris base, 0.89 M 硼酸, 20 mM EDTA 尿素（分子生物学级） 10% 过硫酸铵(APS)：现用现配 TEMED Gel loading buffer: 80%甲酰胺, 1×TBE, 10 mM EDTA 溴酚蓝和二甲苯蓝染料 Clear plastic wrap (SaranTM wrap) Black India ink RNA洗脱缓冲液：0.3 M乙酸钠, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1% SDS 磷屏或X-胶片 0.45-μm孔径的针头滤器 EMSA试剂： Buffer D: 20 mM HEPES (pH 7.0), 0.1 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.4 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% 甘油 10×binding buffer：0.1 M HEPES, pH 7.0, 1 M NaCl 10×phosphate dye: 25 mM 磷酸钾 (pH 7.0), 25%蔗糖, 0.1 mg/mL 溴酚蓝 10×phosphate buffer: 0.25 M 磷酸钾 (pH 7.0) 甘油（分子生物学级） 3mm厚度Whatman滤纸 实验方法： RNase-Free技术要求： 玻璃器皿通过高温消毒方法实现RNase-Free，DEPC处理塑料制品； 实验全程带手套，避免皮肤来源的RNase污染； 避免重复使用枪头； 保持操作台面整洁无尘，移液枪等设备定期清洗； 所有试剂保证无RNase污染； RNA样品操作要格外小心，尽量低温操作。避免RNA样品接触二价离子，高pH值（>9.0）或长时间高温放置。酚-氯仿提取RNA： 向样品中加入等体积的苯酚（注意事项1），剧烈震荡混匀； 10000×g 离心 3 min上层水相转移至新的RNase Free的EP管中（注意事项2）； 重新向苯酚中加入等体积的RNase-Free水混匀后离心收集水相； 向两次收集的水相中加入等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，10000×g 离心 3 min； 上层水相转移至新的离心管中，加入1/10体积的3 M 乙酸钠（pH 5.2），加入预冷的无水乙醇至终体积比浓度为70%，–20℃ 放置大于 1 h（注意事项3）； 室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清； 用等体积的预冷70%乙醇洗涤沉淀，轻轻颠倒混匀数次，立即室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清； 冻干法或阴凉处晾干，沉淀用RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用（注意事项4）。放射标记RNA制备： 常见的放射标记的RNA分为全标记和末端标记两种方式。本方法主要介绍末端标记的探针制备与分离纯化的方法（注意事项5）。 探针分子去磷酸基：在1.5mL的RNase-Free EP管中按下列体积配制反应体系： RNA探针 20μg 10×CIP buffer 20μL CIP (1U/μL) 10μL ddH2O 补充至总体积为200μL 37℃孵育45min。酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。 探针末端标记：在1.5mL的RNase-Free EP管中安下列体积配制反应体系： CIP-treated RNA (1–2μg) 50–80 pmol 10×PNK buffer 2.5μL [γ-32P] ATP (1μCi/μL) 8–10μL PNK (20 U/μL) 1μL ddH2O 补充至总体积为25μL 37℃孵育1.5h。添加25 μLddH2O，酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。为有效去除未准确标记至探针分子中游离[γ-32P] ATP，需要进行探针纯化。探针纯化的方案有两种：酚-氯仿抽提结合分子筛纯化的方法；基于凝胶纯化的方法。凝胶纯化法能获得更高纯度的探针样品。 酚-氯仿抽提结合分子筛纯化： 将待纯化的探针体系加至2-cm bed of G-25 分子筛凝胶柱(Amersham Pharmacia)上（注意事项6）， 14％），凝胶可能不会粘在滤纸上。 在这种情况下，将保鲜膜置于凝胶上，翻转凝胶并铺平，然后将凝胶剥离。 凝胶应粘在保鲜膜上。 然后可以将滤纸放在凝胶的顶部以进行干燥。 对于低浓度凝胶（4％），凝胶可能非常容易变形，使得凝胶带在干燥和显影之后波状起伏。 将凝胶从平板转移到滤纸时要小心。 如果凝胶不会粘附在一块板上，那么将ddH2O喷到凝胶上会有所帮助。参考文献： Maxwell, K.T.G.a.E.S. (2011). Electrophoretic Mobility Shift Assay for Characterizing RNA–Protein Interaction. Methods in molecular biology.
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