图1 免疫球蛋白结构和常见抗体类型

1972年,Porter和Edelman使用木瓜蛋白酶将免疫球蛋白IgG水解成一个可结晶片段Fc和两个抗原结合片段Fab,阐明了抗体的结构而获得了诺贝尔奖[10]。当病原体侵入人体后,抗体会识别病原体,将其包裹呈递给免疫细胞,这时候抗体的可结晶片段Fc可以和免疫细胞Fc受体(FcR)相结合,募集体内的免疫细胞(包括自然杀伤细胞,巨噬细胞),从而能够吞噬病原体或诱导已感染的细胞发生裂解或凋亡,发挥了抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)[8],此外,在人体血清和组织液中存在经活化而具有酶活性的补体蛋白,这些补体能够结合包被抗原表面抗体上的CH2结构域,进一步激活补体依赖性细胞毒性作用(complement dependent cytoxicity,CDC)而发挥免疫活性,但有时还会引起机体损伤,甚至是过敏反应和自身免疫性疾病[11]。有研究表明,这很可能是由抗原的浓度、抗原的形式(单体或多聚体)以及抗原在膜中的定位引起的[12]。另一方面,抗体主要通过抗原互补表位(CDRs)特异性地识别被感染细胞的表面抗原,从而发挥抗体所介导的细胞毒性作用和补体依赖性的细胞毒性作用。IgG样抗体的两个抗原结合片段上,各分布着3个与抗原特异性识别的互补表位(CDRs),它们通过碱基互补可以实现与抗原的直接物理结合[8]。胃蛋白酶从铰链区的下方切割,产生了单个F(ab')2片段(如图1b),此外还有重链和轻链可变区域融合成的单链可变片段scFv,以及在骆驼和鲨鱼体内发现的单个重链可变域组成的单域抗体(sdAb)形式等。单抗结构在翻译后修饰和储存过程中会产生大量的化学修饰,像N、O糖基化修饰,脱酰胺和氧化等,因此抗体和靶标蛋白的结合稳定性与它们结构上的相互作用密不可分。

图 1[8]a免疫球蛋白的一般结构:有四条多肽链组成的“Y”型结构,从上到下可分为两个抗原结合片段Fab和可结晶片段Fc,它们之间通过二硫键柔性连接;四条多肽链里带有共价连接的相同重链(蓝色)和轻链(绿色)各两条,每条多肽链里包括恒定区(CH1、CH2和CL)和可变区(VH和VL),重链之间、重链和轻链之间有不同数量的二硫键(黄色)桥连接。值得注意的是,可结晶片段Fc上的糖基化位点有助于通过与Fc受体结合激活抗体的效应子功能和逃避溶酶体降解(与新生儿Fc受体)。图1b常见单克隆抗体片段有:Fab、F(ab')2、单链可变片段(scFv)和单域抗体(sdAb)。

mAb可以靶向癌细胞表面的多种不同抗原,因此,临床上多被用作诊断试剂。近年来,围绕着PD-1/PD-L1肿瘤靶标衍生出很多种基于抗体的癌症治疗方法如直接针对肿瘤表面抗原、抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、增强或阻断T细胞-癌细胞受体配体间的信号传导、嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)、抗体-药物偶联物以及双特异性抗体疗法等[12]。其中针对T细胞和癌细胞上的PD-1/PD-L1仍是抗体研发的热点。

1.2 PD-1/PD-L1蛋白受体结构和相关临床药物

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是T细胞表面的一种抑制受体,它与其配体PD-L1/PD-L2结合后,募集酪氨酸磷酸酶SHP2向T细胞传递抑制信号[13]。而癌细胞可以通过利用抑制性程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/配体1(PD-L1)免疫检查点来逃避T细胞介导的细胞毒性[14]。基于以上机制,研究人员分别设计出了针对PD-1和PD-L1检查点的抑制剂,如FDA批准的抗PD-1的Nivolumab(O药)、Pembrolizumab(K药)和抗PD-L1的Atezolizumab、Avelumab等单克隆抗体。其中,阿特珠单抗(Atezolizumab)是保留Fc片段的人源化IgG1抗体蛋白,可以选择性抑制PD-1/PD-L1的交互作用,抗体半衰期被延长的同时选择突变Fc区域的特定氨基酸位点,降低了抗体介导的ADCC和CDC作用。通过PD-1/PD-L1受体蛋白及其蛋白抑制剂的晶体结构发现,阿特珠单抗的高亲和力可能取决于它与PD-L1蛋白中央区域环上的5个热点氨基酸残基(56号位酪氨酸,58号位谷氨酸,113号位精氨酸,115号位蛋氨酸和123号位酪氨酸)的相互作用,同时发现这些热点残基在PD-1和PD-L1之间的结合也起到了关键作用[13]。这些单克隆抗体靶向PD-1/PD-L1空间晶体结构的确证促进了单克隆抗体抗肿瘤活性分子机制的研究[13],同时也有利于针对该蛋白结构,特异性的设计小分子抑制剂以及指导抗体制剂的开发与筛选。

2.1 单抗的稳定性

单克隆抗体药物属于蛋白质,稳定性较低,容易受外界环境影响,导致蛋白理化性质的改变,从而造成抗体药物免疫原性的改变,因此提高抗体药物稳定性是生物药物制剂研究的重点[6]。维持蛋白构象完整性的三个稳定力有氢键、静电相互作用和疏水相互作用,其中疏水相互作用起主导作用,可以形成疏水簇来稳定蛋白质。此外,蛋白的稳定性与它的胶体性质有关,即聚集和分散。两者可以通过蛋白相互作用参数(kD)或第二维里系数(A2)来定量,而且两个参数之间有很好的相关性[15]。同样,蛋白稳定性曲线下的面积也能很好地评估蛋白的相对稳定性。

2.2 抗体制剂开发的前期考察

在制剂开发之前,最好是在早期的药物发现阶段,需要谨慎地评估候选药物的可开发性和作为药品上市的可能性[16]。前期可以通过计算机模拟估算候选药物的蛋白质相互作用参数(kD),进一步对药物热稳定性、粘度和表观溶解度等理化性质以及抗体降解趋势做出预测[17,18]。完成开发性评估后首先要进行强制降解的研究,分析蛋白在极端pH、高温、强光、强氧化和强机械力下的降解产物,为后期稳定性分析提供测定依据[19]。抗体制剂开发应该符合ICH(international conference on harmonization)中“质量源于设计”(QbD)的理念,所有的实验设计最终都要保证开发产品符合过程的合理性和满足预期目标产品质量的达标率。

2.3 影响蛋白稳定性的因素

蛋白质稳定性影响因素主要包括溶液内部条件、外界环境(温度和光照)、外源污染物、接触表面以及生产加工过程等因素[20],这些因素降低了抗体蛋白的构象稳定性和胶体稳定性,导致蛋白的降解和聚集,如表1。稳定性研究旨在开发出更适宜和低风险的制剂配方,实现产品稳定性最大化。寻找最佳的抗体配方受到很多的因素限制,在传统制剂配方的规则之外,也有许多的例外。因此,配方开发需要系统性的实验设计(design of experiment,DoE),为了减少配方筛选的实验次数,在传统制剂开发的基础上,通过传统经验选择与质量响应更高的因素作为抗体药物稳定性研究的关键因素,包括温度、pH、离子强度、缓冲液成分和药物辅料以及生产储存条件等[21]。

2.3.1 溶液pH

对于具有蛋白质结构的单抗药物来说,pH值是影响其理化性质改变,降低药物储存、运输过程稳定性的主要因素。Maroju等[21]发现溶液的pH影响着蛋白质表面电荷类型,显著改变着蛋白质聚集和降解的速率。同时蛋白溶解度是单抗药物在溶液媒介中表征聚集的最主要指标,pH值会影响蛋白质的溶解度、粘度和溶液相性质,使其远离蛋白质的pI值[20]。Cui等[22]发现狭窄的pH范围为我们探索溶液最适pH减少了实验次数,在52种单克隆抗体中,一半以上pH稳定在5.5~6.5范围内。一个最适的pH值,有时往往需要选择不同组合的缓冲体系如磷酸盐、醋酸盐缓冲液来实现,从而减小溶液pH变化对药物物理化学稳定性的影响[23]。而高浓度蛋白溶液(大于50 mg/ml)具有一定的缓冲能力,能够维持溶液的pH,有时为了避免缓冲液带来的负面影响,也可以选择不添加[23]。抗体的构象稳定性会随着抗体浓度增加而变高或变低,所以抗体会有维持稳定的最佳浓度。但大多数单克隆抗体药物的浓度有限,如PD-1抗体药物Opdivo最佳浓度为10 mg/ml,制剂处方常采用针对特异抗体性质的缓冲液体系,将pH维持在最适范围之内。

2.3.2 离子强度

溶液中离子强度和pH相似,通过改变抗体表面电荷来控制蛋白的稳定性。适当的盐浓度能够增强蛋白间的疏水性相互作用,增加蛋白药物的聚集。对于溶液中引入的二价阳离子,如锌离子会催化氧自由基或与带负电的氨基酸侧链产生静电作用而降低蛋白的稳定性,常加入一些金属离子螯合剂(EDTA和DTPA)来去除。

2.3.3 缓冲液成分

缓冲液的类型和浓度会影响抗体蛋白在溶液中的热稳定性、构象稳定性和粘度等性质。应用最为广泛的缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐和组氨酸盐酸盐等。磷酸盐缓冲液pH范围在6.2~8.2,同时磷酸根离子可以与带正电的侧链基团发生相互作用而对蛋白质的稳定性起到保护作用。柠檬酸盐作为一种无毒且通用的缓冲液,其pH缓冲范围在2.1~7.4之间,同时柠檬酸可以直接以化学键连接的方式对蛋白质进行修饰[23]。在抗体制剂工艺开发中,稳定的缓冲体系往往是通过大量的pH梯度筛选实验得到的。因此,缓冲液维持蛋白溶液pH在最稳定范围,往往取决于缓冲液的类型以及溶液里其他成分包括稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂等所占的比例。

2.3.4 药物辅料

除活性成分和缓冲液之外,药物辅料在制剂处方中也起到了至关重要的调节作用,它由起稳定作用的赋形剂组成,包括表面活性剂、氨基酸、糖或糖醇、螯合剂和张力调节剂等。而药物辅料的筛选常常从FDA中的安全辅料文库(generally recognized as safe,GRAS)里选择。Falconer等[23]发现赋形剂可以通过与蛋白药物表面直接相互作用(静电力、氢键等)来减少单抗药物的氧化、聚集和水解,还可以通过与水竞争或优先水合作用将药物包裹保护,从而提高其溶解度或结构稳定性(抑制聚集)等。

表面活性剂可以将蛋白质从两相液面上进行置换,有利于减小单抗药物与固-液界面和气-液界面之间的相互作用[24] 从而减少损失和污染。空气和固体表面如瓶壁处的蛋白质分子很容易缔合在其表面,降低药物浓度从而影响单抗药物的稳定性。Maruno等[25]在几种商业单抗药物制剂中,统计后发现硅烷化玻璃表面吸附IgG抗体蛋白的数量在0.6~0.9 μg/cm2。此外,药物会直接接触加工设备或给药组件的各种表面,如不锈钢、丁基橡胶、多聚物的过滤器和预充针注射器的硅烷化玻璃表面等,这些表面的浸出物容易溶解到药液里造成污染和形成可见异物。其中硅油被广泛用于小瓶塞或预充针针筒表面,为了减少硅油与蛋白质的相互作用,可以选择使用烘焙有机硅或添加简单的表面活性剂。国内治疗性单克隆抗体药物中常用的表面活性剂是聚山梨酯80,由于其具有微量毒性和可能存在的降解杂质(游离脂肪酸),用量需要严格地控制。

蛋白质分子质量较大,聚集成为了主要问题,另一种常用于减少单抗药物聚集的赋形剂为氨基酸,包括L-甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸和蛋氨酸等。氨基酸主要通过氢键和静电相互作用来稳定蛋白质。例如脯氨酸里的吡咯烷环与蛋白疏水残基(CH-π)相互作用而降低高浓度单抗药物的粘度[26],带有正电荷基团和胍基结构的精氨酸作为减少蛋白聚集的稳定剂而被广泛使用[24]。组氨酸也常被添加到缓冲液,优势在于其带有的低电荷密度咪唑基团能够提高蛋白溶解度而稳定蛋白质,其次它的pH缓冲范围在5.0~6.5之间,接近人体的生理pH。蛋氨酸作为氢键供体或受体常与氧自由基化学结合从而保护了蛋白质上的蛋氨酸侧链[27],相反,氨基酸对蛋白稳定性也有一定的负面影响,色氨酸可以高效地将光能传递到氧气,促进活性氧(ROS)的产生,从而氧化蛋白[28]。Platts L等人发现精氨酸、甘氨酸与蛋白质侧链之间的作用存在着浓度依赖性[29],低于100 mmol/L的精氨酸起到了蛋白稳定性作用,而高于100 mmol/L的精氨酸则表现出类似于盐酸胍的去稳定性作用。此外,其他氨基酸如天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸也已应用到蛋白制剂中,但其功能还有待进一步的开发利用,也为发现新颖的氨基酸赋形剂提供了更多机会[24]。

中性糖和糖醇也是抗体制剂处方的重要赋形剂之一。糖分子可以压缩蛋白质结构,减少溶剂可及性,有效减小抗体蛋白体积排阻,降低其局部弹性而提高稳定性[30,31]。常用糖和糖醇是蔗糖、海藻糖和甘露醇。研究表明,海藻糖在蛋白周围更容易形成糖壳[32]。但蔗糖较海藻糖在单克隆抗体制剂配方中却更常用,这可能考虑到配方成分间的协同作用,如表2。

临床上单抗药物制剂给药方式常为注射给药,人体的渗透压正常值在280~310mOsm/L之间,该范围内的蛋白溶液称为等渗溶液。过高或过低溶液注射或者滴注时,都会给患者带来疼痛感,成为药物治疗的重要阻碍,添加张力调节剂旨在减小注射或滴注药物时的疼痛感,改善患者用药的依从性和顺应性。单抗药物的渗透压接近290mOsm/L,加入以氯化钠、甘露醇、山梨糖醇、甘油、蔗糖以及海藻糖为主的张力调节剂,如规格为25mg/ml的抗PD-1单克隆抗体药物(Keytruda)冻干粉针中加入了140mg的蔗糖。根据蛋白之间容易产生的相互作用、可预测的蛋白理化性质改变和临床上推荐的给药方式,不同抗体药物制剂需要选择最适宜的药物辅料组合,如人源化IgG4双特异性抗体HemlibraTM采取了精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和泊洛沙姆的创新组合配方而在临床上效果显著[23]。国产PD-1抗体特瑞普利单抗和信迪利单抗的制剂组成较为类似,都包含了枸橼酸-枸橼酸钠组成的缓冲体系,甘露醇、聚山梨酯80等药物辅料,不同于卡瑞利珠单抗。而信迪利单抗注射液可能基于考虑实际生产工艺的需求,在溶液里补加了组氨酸和金属离子螯合剂依地酸二钠(EDTA-2Na)。因此抗体药物制剂配方筛选时常根据在研抗体的特异性和实际生产情况采用更为灵活的辅料组合。

抗体类的生物药物完成体内外药效,药理毒理学研究,申请临床前需要报药品审评中心(CDE),对所开发的抗体药物制剂在前期药学实验和生物制品稳定性研究等临床前试验进行检验核查,其中生物制剂的稳定性研究是重点,提交审评过程中可关注以下几点。

3.1 样品

研究样品通常包括蛋白原液,中间品,成品及自身的稀释液或重悬液。《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》规定“样品批次数量至少为三批,研究用成品应来自不同批次原液,不同研究样品应采用与实际贮存相同的包装容器和密闭系统”,另一方面,研究用蛋白样品来自实际生产,成本比较高,这就需要我们根据检测样品的代表性,合理的设计研究方案,减少对部分样品的检测频率。

3.2 冻融和运输稳定性

制剂稳定性研究前,经下游纯化的蛋白原液常储存在-80℃冰箱里,所以,原液可能涉及反复冻融,容易影响到蛋白构象的稳定性。《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》规定“对于需冷冻保存的原液、中间产物,应验证其在多次反复冻融条件下产品质量的变化情况”。同时,不同包装材料对抗体制剂的冻融可能会有影响[6]。此外,运输过程中的温度、振动等变化因素会影响抗体制剂的稳定性,尤其对冻干制剂,实际过程中应采用冷链运输,应对产品脱离冷链的温度、次数、总时间等制定相应的要求,还应考虑使用时药物的抽取,因此,液体制剂改为冻干制剂时,需要综合评估在pH和离子浓度改变,储存运输条件改变时抗体制剂稳定性的情况。

3.3 临床应用

临床上抗体制剂多为液体制剂或冻干粉,使用时常采用输液袋滴注的静脉给药方式,需要将药物抽取出注入输液袋中,用生理盐水等稀释液稀释后给药。《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》规定“模拟实际使用情况的研究应考虑产品使用、存放的方式和条件,如注射器多次插入与抽出的影响等”,对于单次给药时间长(如静脉滴注)、使用前需要配制的,应开展相应的稳定性研究。此外,关于输液袋和稀释液可能造成制剂稳定性的降低,需要评估产品实际使用情况下的临床稳定性。

生物制剂处方开发是抗体药物研发的关键一步,为了将药品推上临床和市场以及保持竞争力,需要对产品安全性、有效性和稳定性以及其他综合风险作出快速评估。因此,制剂开发往往涉及到药物开发早期和药品开发的各个环节。对于抗体制剂的前期考察和结果预测十分重要,后期制剂配方稳定性开发在传统抗体配方经验基础上,需要对溶液pH、离子强度、缓冲液成分、可用赋形剂等影响因素进行综合筛选,得到独特稳定的配方。市场上大部分针对PD-1/PD-L1单抗制剂都是液体制剂,但有时也有例外,当溶液成分配比无法满足其稳定性时,常采用其他途径如PEG或β-环糊精化学修饰和制成冻干剂型等。单克隆抗体制剂稳定性的开发主要取决于抗体蛋白稳定结构的构建。针对PD-1/PD-L1免疫检查点结构域的深入研究,单个氨基酸的突变可能有利于增强蛋白-蛋白之间的结合作用,从而极大地提高抗体制剂的稳定性,同时靶标蛋白的基因序列、三维结构和功能被不断完善,这对于新药的发现和制剂开发也有着深远影响。

未来单克隆抗体药物剂型的多样化,双特异性抗体制剂的开发等发展趋势都对抗体制剂处方稳定性的研发带来了挑战,稳定的制剂开发需要进一步探索。

文献来源

吝建华, 韩君, 徐寒梅. PD-1/PD-L1免疫检查点抗体药物制剂稳定性开发[J]. 中国生物工程杂志, 2020, 40(10): 35-42返回搜狐，查看更多