HPLC是通过色谱柱进行样品分离的。HPLC用色谱柱中充满了填料，这种填料一般被称为凝胶。凝胶是由直径为3~15 μm（μm=1/1000 mm）的非常微小的颗粒组成的。凝胶有各种不同的结构，由于样品中的各成分在色谱柱中的停留时间、和各种凝胶的相互作用不同，通过这种差异，就能进行样品中各成分的分离。

分离条件的变化，在液体色谱方面是指流动相的组成和pH值的变化以及色谱柱温度的改变。像这样，通过改变分离条件使不能够分离的成分得到分离，使原先能分离的成分无法分离，是液相色谱分析过程中的难点，也是能显示分析者技术的地方。 HPLC用色谱柱，填料的基材有很多种类，即使相同的基材上面也连接了各种各样的化学修饰（指连接在基材上的官能团，关于这方面内容会在11节详细说明），就形成了很多不同的色谱柱。Shodex的色谱柱有800多个种类。反过来说，在800多种色谱柱中，选择最合适的色谱柱是非常重要的。

HPLC色谱柱中被分离的样品成分通过检测器，由记录器得出的理想谱图应该是像（图-5）的a）所显示的这种左右对称的图形（也称为峰）。如果测定上有问题，就会形成左右不对称，类似于b这样前沿平缓，后沿陡峭的前延峰和类似于c这样前沿陡峭，后沿平缓的拖尾峰。另外，所形成的峰越窄越好。分离效果好就会形成像（图-6）的a这样峰宽较窄的峰，分离效果不好就会形成b那样峰宽较宽的峰。理论塔板数也是判断色谱柱性能的一个参数。理论塔板数越大色谱柱性能越好。然而，理论塔板数和色谱柱的长度有关，色谱柱的长度变成2倍，或者使用2个色谱柱，那么理论塔板数就会变为原先的2倍。在比较Shodex和其他公司色谱柱的时候，必须确认色谱柱的长度是否一致。另外，Shodex目录上表示的理论塔板数是以「个」为单位测量的，根据制造商的不同，也有以「m」为单位测试的情况，必须特别注意。虽然色谱柱的内径发生变化，对色谱柱的理论塔板数也有少许影响。但和长度造成的影响比起来，这种影响非常微小。另外，即使是同一个色谱柱，如果测试样品时的装置和测定方法不同也会使理论塔板数发生变化，这点也需要特别注意。

然后，分析一下样品中有2个成分时的分离情况。像（图-7）a表示的那样得到两个峰的情况说明样品被完全分离；像b、c那样2个峰某些部分重叠在一起，则说明分离效果不佳。理论塔板数高的色谱柱因为峰宽很窄，2个峰重合的可能性比理论塔板数低的色谱柱少很多。

通过改变流动相和分离条件，也有可能避免峰重合，但是比起改变测定条件这种方法，色谱柱的选择更加重要。

虽然只是测定样品中有哪些成分的实验（称为定性试验），b、c这样的谱图也能达到要求，但是如果要分析样品中各成分的含量（称为定量试验），得不到a这样的分离结果就无法正确测定成分的含量。

硅胶是使用非常广泛的一种基本填料。其化学式是SiO2。举身边的例子来说，硅胶经常被作为点心包装内的干燥剂使用。然而，作为干燥剂使用的是直径在1 mm以上的大规格颗粒，作为填料使用的是直径在1 μm~数十 μm范围内的非常微小的颗粒。硅胶有不规则型（被称为破碎状凝胶）和球型（被称为球状凝胶）2种规格。以前，有破碎状凝胶是普通产品，球状凝胶是高级产品的概念，但是如今，硅胶大多指的都是球状凝胶。硅胶的表面都开有小孔，因为和不开孔的凝胶比起来，开孔可以增加表面积。这种孔的孔径非常小，单位是Å（1米的百亿分之一），开了孔的硅胶也被称为多孔性硅胶。

硅胶柱的性能指标有以下几个参数可供参考。

HPLC发展初期，色谱柱指的就是硅胶色谱柱，最近聚合物（高分子）凝胶填充的聚合物基质色谱柱越来越被广泛使用。常用的聚合物基质有聚乙烯和聚丙烯等，Shodex的HPLC用聚合物基质凝胶有以下几种。

聚合物基质凝胶和硅胶一样，使用了多孔性的凝胶。

除了硅胶和聚合物凝胶，天然的纤维素、琼脂糖、糊精、壳聚糖、羟磷灰石，氧化锆等也能作为填料，但是使用的情况非常少。所以考虑填料种类的时候，一般只考虑硅胶和聚合物凝胶2种类型。

HPLC有多种分离模式。Shodex有800多种色谱柱配合所有的分离模式。

各种分离模式所对应的色谱柱将在第三部分予以说明。