深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)通过植入相关脑区的电极施加100 Hz左右的电脉冲高频刺激(high frequency stimulation，HFS)，可用于控制和治疗多种神经系统疾病和精神疾病.例如，DBS已广泛用于临床治疗帕金森病，并且在肌张力障碍、难治性癫痫、难治性抑郁症、阿尔茨海默病等治疗上也展现出良好的应用前景[1-4].与药物干预和手术切除病灶组织等其他治疗方法相比，DBS具有起效迅速、效果可逆、副作用小、参数可调等优点，因而在临床和脑科学研究领域都受到广泛关注和重视.然而，DBS所采用的HFS的作用机制至今尚未完全明确[5]，这阻碍了DBS应用的快速发展和推广.

早期的研究认为，HFS会抑制目标神经元的发放或者使目标神经元失活[6-7].然而许多研究表明，在HFS期间，下游神经元并非处于静息状态，有时它们的动作电位发放甚至比电刺激前的基础水平还要高[8-10].还有研究表明，HFS可以改变受刺激区域内轴突纤维的功能，产生不完全的轴突传导阻滞，而HFS中包含的电脉冲又可以通过这种不彻底的传导阻滞，对下游神经元产生适当的兴奋作用，从而调制下游神经元产生非同步发放，取代病理性的同步发放[11-13].

相比于胞体、树突等神经元的其他组成部分，承担信息传导功能的轴突纤维在脑内空间的占比最大，而且轴突对于HFS中的窄脉冲刺激较敏感，兴奋阈值较低，更易被电刺激激活[14].因此，HFS可能首先激活电极附近的轴突纤维[15]，然后，轴突将兴奋传导至末梢的突触，再经过突触的传递间接地激活下游神经元群体[16-17]，由此将刺激的作用投射至广泛的脑区.DBS治疗的有效HFS频率范围是80~185 Hz[18].这种高频刺激的初期，轴突等神经元的组成部分还能够跟上刺激节奏.但是，随着刺激的持续，轴突、突触等结构的功能可能发生变化[13, 17]，出现障碍，如轴突传导阻滞等.因此，神经元产生的动作电位与刺激脉冲之间的关系会随着刺激时间的延续而改变，即下游神经元对于HFS的响应可能存在动态变化.研究这种动态过程有助于深入了解DBS的作用机制，也可以为DBS新刺激模式的开发提供信息.因此，本文在体研究大鼠海马CA1区神经元对于传入轴突纤维上HFS的动态响应.

在CA1区的传入轴突纤维Schaffer侧支上施加100 Hz的HFS[19]，考察锥体神经元(pyramidal cell)和中间神经元(interneuron)的动作电位，即单元锋电位(single unit activity，SUA)的发放情况.探讨的问题是：随着HFS的进行，位于刺激下游的两类神经元所产生的锋电位与刺激脉冲之间的关系(即锁相性和潜伏期)的变化.

由于海马脑区与学习记忆、情绪控制和毒品成瘾等密切相关，是癫痫、阿尔茨海默病等疾病的常见病灶区，因此，海马脑区的电刺激研究对于开发治疗某些神经系统疾病(如难治性癫痫、记忆障碍、抑郁症、药物成瘾等)的DBS新技术具有重要意义[3-4, 20-21].

雄性成年Sprague-Dawley大鼠16只(体重240~360 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心).腹腔注射乌拉坦(urethane，1.25 g/kg)麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上.切开头部皮肤，除去部分颅骨以置入电极[11, 22].

记录电极(recording electrode，RE)采用美国NeuroNexus Technologies公司生产的16通道微电极阵列(2 × 8线性双列，记录位点间距50 μm)，植入至海马CA1区，定位于前囟后3.5 mm，旁开2.7 mm，由皮层表面向下约2.5 mm，直至记录到明显的CA1区锋电位信号为止.顺向刺激电极(orthodromic stimulating electrode，OSE)采用美国FHC公司的同芯双极不锈钢电极，植入至记录电极上游的CA1区输入通道(即轴突纤维束Schaffer侧支)，用于施加高频脉冲刺激.定位于前囟后2.2 mm，旁开2.0 mm，由皮层表面向下约2.8 mm.根据OSE上施加单脉冲刺激时在RE上记录到的顺向诱发群峰电位(population spike，PS)的波形，微调两电极至最佳位置[23].

记录电极采集的信号经16通道放大器(3600型，A-M Systems Inc.，美国)放大100倍(频率范围设定为0.3~5 000 Hz)，然后使用ML880 PowerLab 16/30型多通道信号采集系统(ADInstuments Inc.，澳大利亚)，以20 kHz的采样率采样(A/D转换分辨率为16位)，并将数据存入硬盘，用于离线分析.

施加的电刺激是脉宽为0.1 ms的双相电流型脉冲，由3800型刺激器(A-M Systems Inc.，美国)产生.HFS的脉冲频率设定为100 Hz，刺激持续时间为1 min，刺激的电流强度设定为单脉冲刺激能够诱发出的PS为最大幅值的75%时的电流值，约为0.3~0.5 mA.

在16通道记录信号中，选择位于CA1区胞体层的4路相邻通道所记录的信号来检测HFS期间的神经元锋电位.信号处理过程与文献[12]相似，简述如下：首先，应用线性插值法去除原始记录信号中的刺激伪迹(stimulation artifacts，SA)[24].然后，对去除SA后的宽频带信号(0.3~5 000 Hz)进行高通滤波，截止频率设定为500 Hz，以去除低频的局部场电位(local field potential，LFP)，获得多单元锋电位信号(multiple unit activity，MUA).最后，应用阈值法检测4路MUA信号中的锋电位，并提取锋电位的幅值等特征值用于分类，进而获得单元锋电位信号.

海马CA1区胞体层记录到的锋电位来自锥体和中间两种神经元.利用锋电位波形特征和发放特性来区分不同神经元的锋电位：从宽频带记录信号中提取同类锋电位，计算其平均波形的后半波的宽度.若宽度大于0.7 ms，则归为锥体神经元的锋电位；若宽度小于0.4 ms，则归为中间神经元的锋电位[25].此外，再根据基线记录时锋电位的发放特性进一步验证神经元类型：锥体神经元为爆发式发放，且发放率较低；而中间神经元的发放则较均匀，且发放率较高[25].

为了研究HFS期间两种神经元锋电位的发放与刺激脉冲之间关系的动态变化，本文将1 min时长的HFS分为前、后各30 s.其中，前30 s内可能存在神经元的同步发放(即PS波)，会干扰单元锋电位信号的提取[12]，因此，在考察锋电位变化时，本文分析HFS的后30 s.并将后30 s平均分为3个时区，各10 s.分别计算这3个时区中锋电位的平均发放率，并利用刺激后时间直方图(peri-stimulus time histogram，PSTH)、锁相值和潜伏期，来定量分析锋电位的发放与刺激脉冲之间的关系.

本文采用的HFS脉冲频率为100 Hz，因此，PSTH的时间坐标为0~10 ms，分辨率为0.05 ms(即原始信号的采样周期).PSTH图呈现单峰分布，为了定量描述此锋电位分布峰的集中程度，计算PSTH中锋电位的锁相值(phase-locking value，PLV)，其定义为[26-27]：

式中，αi和ejαi分别是第i个锋电位发放时间点在PSTH周期中的相位角和单位矢量，j=. n为锋电位个数.PLV无量纲，取值为0~1.PLV=1时，表示锋电位与HFS的刺激脉冲完全锁相；PLV=0时，表示锋电位的发放与HFS的刺激脉冲之间无锁相关系.

刺激脉冲在轴突上产生兴奋并导致下游神经元产生动作电位所需的时间称为锋电位的潜伏期.利用PSTH数据可以计算每个锋电位与其前导脉冲之间的时间差，但此时间差并不一定是潜伏期.由于HFS期间刺激脉冲的周期性特点，各神经元锋电位的平均潜伏期需要利用圆分布统计学的算法来计算[28].也就是，计算PSTH数据的圆分布平均角，再将求得的角度转化为时间数值，才能得到平均潜伏期.此外，如果由此计算获得的平均潜伏期小于5 ms，而且锋电位的PSTH波峰呈现跨周期分布，那么，则认为激发该锋电位发放的刺激脉冲不是本周期的前导脉冲，而是再前一个脉冲，因此，将该神经元的潜伏期数值增加一个周期的时长(即10 ms).

文中统计数据均表示为“均值±标准差”.HFS期间锥体和中间两种神经元数据之间差别的显著性用t检验来评价；而HFS期间不同的2个时区数据之间差别的显著性则用配对t检验来评价.

此外，为了直观显示HFS期间锋电位发放与刺激脉冲之间的关系随时间发生变化，本文还采用二维彩色光栅图来描述各个神经元的锋电位发放序列在100 Hz刺激的10 ms周期中的分布.光栅图的两个坐标分别是HFS的持续时间(0~60 s)和刺激脉冲的周期(0~10 ms).图中每条“光栅”序列是每秒HFS所包含的100个刺激周期的叠加，光栅点的颜色表示该点上锋电位的个数.

与已有研究结果相似[11-12]，在海马CA1区的Schaffer侧支上施加1 min时长的HFS(图 1a)，在HFS起始的数秒内会诱发下游神经元同步发放动作电位，从而产生大幅值的PS活动(图 1b上图).而随着HFS的持续，PS逐渐消失，但是，多单元锋电位信号(MUA)继续存在(图 1b下图).这表明HFS的刺激脉冲不再同步诱发神经元群体产生动作电位.下面研究PS消失后神经元发放的锋电位与刺激脉冲之间关系的变化.

图 1c所示是二维光栅图，显示了图 1b信号中某个中间神经元在HFS的脉冲间隔间的锋电位发放分布.可见，PS活动刚消失时(约HFS的15 s时，图 1c~e红色虚线所示)，锋电位的发放较集中，发放率为84 spikes/s，锋电位与刺激脉冲之间的锁相较明显(PLV=0.99)，且潜伏期较短(5.4 ms).在HFS的后续15 ~ 60 s期间，发放率较稳定(图 1c红色曲线)，而PLV逐渐减小(图 1d)，且潜伏期逐渐延长(图 1e).在HFS的50~60 s期间，锋电位平均发放率为(76.3 ± 5.8) spikes/s；锁相值PLV为(0.96 ± 0.01)，潜伏期为(6.7 ± 0.1) ms，n=763个锋电位.

此结果表明，随着输入轴突上HFS的持续，下游神经元的动作电位发放与刺激脉冲之间的锁相性会逐渐减弱，而潜伏期则逐渐延长.由于下游CA1区的局部神经网络中存在两类神经元，即兴奋性的锥体神经元和抑制性的中间神经元，且两者响应兴奋性输入的阈值不同，中间神经元的阈值较低[29].为了揭示它们对于HFS响应的差别，下面分析和比较两者的锋电位发放在HFS期间的变化规律.

本文在16只大鼠的实验中共分析了66个锥体神经元和20个中间神经元的锋电位.在1 min时长的100 Hz HFS期间，避开前30 s可能出现PS活动的时区.在HFS的后30 s内，两种神经元的平均发放率均高于基线期(表 1).为了考察此30 s内神经元的发放与HFS之间的关系是否随时间变化，将30 s分成3个10 s时区，比较头尾2个时区，即HFS的30~40 s和50~60 s这2个时区之间的差别.如表 1所示，同类神经元在这2个时区的平均发放率并没有显著差异(paired t-test，P＞0.45).这表明神经元动作电位的发放已稳定.

此外，中间神经元的平均发放率显著高于锥体神经元的平均发放率(t-test，P＜0.01).但是，无论锥体和中间神经元，它们的发放率均小于刺激的脉冲频率(100 Hz)，表明两类神经元都不能完全跟随每个刺激脉冲产生动作电位.

在这3个时区(Zone1：30~40 s；Zone2：40~50 s；Zone3：50~60 s)中，虽然第1与第3个时区的锋电位发放率没有显著变化，但是，锋电位与刺激脉冲之间的锁相值和潜伏期都存在显著差异.例如，由图 2a的锥体神经元示例可见，锋电位序列在二维光栅图上存在明显的移动(图 2a-1).在Zone1(图 2a-2)，锋电位的锁相值PLV为0.90，平均潜伏期为8.8 ms.而到了Zone3(图 2a-3)，锋电位在PSTH的分布峰后移，其平均潜伏期延长为10.4 ms，而PLV也降为0.68.同样地，由图 2b的中间神经元示例可见，锋电位序列在二维光栅图上的移动更明显(图 2b-1).比较Zone1(图 2b-2)与Zone3(图 2b-3)的PSTH图可见，锋电位的分布峰后移且峰值减小(趋于平坦).期间，该中间神经元锋电位的平均潜伏期由6.1 ms延长为6.9 ms，而PLV由0.97降为0.94.

由锁相值PLV的统计数据可见(图 3a)：对于锥体神经元，第1时区(Zone1，30~40 s)到第3时区(Zone3，50~60 s)，PLV从(0.73 ± 0.18)显著减小至(0.56 ± 0.20)(P＜0.01，paired t-test，n= 66)，且在第1与第3时区的PLV散点图上可见(图 3a-2), 第1时区的PLV多数均大于第3时区(大多数的数据点分布于对角线以上区域).而第2时区(Zone2，40~50 s)的平均PLV为(0.62 ± 0.23)，与第1时区和第3时区的平均PLV都差异显著(P＜0.01，paired t-test，n= 66)，但相对于图 3a-2，在第2与第3时区的PLV散点图上(图 3a-3)，位于对角线下方的数据点增多.这表明在这3个时区内，锥体神经元的PLV持续减小.对于中间神经元，第1时区到第3时区，PLV从(0.87 ± 0.07)显著减小至(0.83 ± 0.07)(P＜0.01，paired t-test，n= 20).且在两时区的PLV散点图上数据点几乎都位于对角线上方(图 3a-4).而第2时区的平均PLV为(0.84±0.10)，与第1时区的平均PLV差异显著(P＜0.01，paired t-test，n= 20)，而与第3时区的平均PLV无显著差异(P= 0.68，paired t-test，n= 20).第2与第3时区的PLV散点图上的数据点围绕对角线分布也表明了同样的结果(图 3a-5).

由潜伏期的统计数据可见(图 3b)：对于锥体神经元，第1时区到第3时区，平均潜伏期从(9.6 ± 1.8) ms显著延长至(10.3 ± 2.0) ms(P＜0.01，paired t-test，n= 66)；且在第1与第3时区的潜伏期散点图上可见(图 3b-2)，第1时区的潜伏期多数均小于第3时区(大多数的数据点分布于对角线以下区域).而第2时区的平均潜伏期为(9.9 ± 1.9) ms，与第1时区和第3时区的平均PLV均差异显著(P＜0.01，paired t-test，n= 66)，但相对于图 3b-2，第2与第3时区的潜伏期散点图上的数据点向对角线上方移动(图 3b-3).对于中间神经元，第1时区到第3时区，潜伏期从(7.3 ± 0.71) ms显著延长至(7.8± 0.70) ms (P＜0.01，paired t-test，n= 20).且在两时区的潜伏期散点图上数据点几乎都位于对角线下方(图 3b-4).而第2时区的平均潜伏期为(7.6 ± 0.68) ms，与第1时区和第3时区的平均PLV均差异显著(P＜0.01，paired t-test，n= 66)，但相对于图 3b-4，第2与第3时区的潜伏期散点图上的数据点向对角线上方移动(图 3b-5).可见，在HFS的30~60 s内，锥体和中间神经元的潜伏期持续延长.

此外，将100 Hz HFS期间同一时区的锥体神经元与中间神经元相比较，它们的锁相值PLV和潜伏期均存在显著差异，中间神经元的PLV显著大于锥体神经元(P＜0.01，t-test，图 3a-1)，而潜伏期则显著小于锥体神经元(P＜0.01, t-test, 图 3b-1).而且，在整个后30 s的HFS中，锥体神经元PLV的变化量(|第3时区的值-第1时区的值|=0.166 ± 0.117)显著大于中间神经元的数值(0.043 ± 0.038)(P＜0.01，t-test).

上述结果表明，随着高频刺激的持续，下游神经元动作电位发放与刺激脉冲之间的锁相关系会减弱，潜伏期会延长，而且，锥体神经元锋电位的锁相值变化大于中间神经元.

本文研究了在体大鼠海马CA1区高频电脉冲刺激(HFS)持续时，位于下游的锥体神经元和中间神经元的动作电位发放的改变.结果表明，除了HFS起始时诱发的神经元群体同步活动(即群峰电位PS)以外，在接下来的刺激期间，下游的两类神经元的单元锋电位发放率都比刺激前显著增加，但是，它们的发放率都远小于刺激频率(表 1).而且，锋电位的发放与刺激脉冲之间的锁相关系逐渐减弱，潜伏期逐渐延长.其中的机制分析如下.

可以明确的是，HFS期间的锋电位发放是由刺激脉冲诱发的，不是自发的基础活动.这是由于每当HFS结束时，总是存在一段没有锋电位的静息期(图 1b)，因此，可以确定HFS对于神经元的锋电位发放具有重要作用，详见文献[12].而输入轴突纤维上的HFS引起的兴奋需要经过轴突的传导和突触的传递，才能作用于下游的突触后神经元(图 1a)，因此，轴突和突触性能的改变以及突触后神经元特性的不同，都会影响刺激脉冲诱发下游神经元产生动作电位的过程和结果.其中HFS引起的轴突性能的改变可能是主要原因.

已有的研究表明，高频电刺激可以改变被刺激轴突纤维的性能，产生不完全的(或者间歇性的)轴突传导阻滞[11-13].这种阻滞使得HFS中的一部分刺激脉冲无法沿轴突传向下游，因而无法激活下游神经元，从而使得下游神经元的动作电位发放率远小于刺激脉冲的100 Hz频率(表 1).而且，每个神经元同时接收上游多根轴突产生的众多突触的输入[19]，HFS引起轴突阻滞时各轴突兴奋状态的不确定性，会增加下游神经元的突触后膜电位整合结果的随机性，由此导致神经元动作电位发放与刺激脉冲的锁相性减弱，潜伏期延长.轴突传导阻滞的原因可能是高频刺激导致轴突膜外的局部范围内钾离子积累、浓度升高[30]，致使轴突细胞膜持续位于一定的去极化状态，而引起部分钠离子通道失活[31]，使得轴突的兴奋阈值升高或者无法产生动作电位，HFS对于下游神经元的作用也就减弱，无法以脉冲的频率来激活神经元.

除了轴突传导障碍以外，HFS也可能引起突触传递的障碍(如神经递质耗竭等)和突触的可塑性变化[13]，这些机制还有待深入研究.本文的大鼠实验采用乌拉坦(urethane)作为麻醉剂，这种麻醉剂常用于大鼠在体神经系统研究的实验.前人的许多研究结果已表明，乌拉坦对于神经元的动作电位发放率仅有较小的抑制作用，对于兴奋性和抑制性突触的传递影响也很小[32].因此，麻醉剂对于本文的结果不会造成明显的影响.

此外，突触后下游神经元自身的特性也会影响其动作电位的产生.由于中间神经元的兴奋阈值比锥体神经元低[29]，因此，其发放率相对较高，潜伏期较小，与刺激脉冲之间的锁相性也高于锥体神经元.

前人的研究曾发现，在丘脑底核施加高频电刺激期间，位于刺激下游的苍白球神经元的单元锋电位发放也存在动态变化，表现为潜伏期的延长和PSTH峰值幅度的降低[16]，与本文所观察到的海马CA1区HFS期间神经元锋电位的潜伏期延长和锁相性减弱一致.这表明，HFS对于下游神经元的动态调控可能普遍存在于各个脑区.由于轴突纤维在脑内空间的占比较大，本文的轴突电刺激实验提示这种调控很可能源于轴突机制.此外，神经元锋电位锁相性的减弱还反映了高频刺激可能具有去同步作用.近年来，这种作用已受到广泛关注，可能是DBS抑制帕金森病和癫痫等疾病所导致的神经元同步活动的重要机制[33-35].再者，常规DBS的刺激持续时间较长，可达数小时、数天和数年.而近来DBS新技术开发的热点之一是闭环刺激(或称自适应刺激)，由数秒或者数分钟的较短刺激组成[36-37].本文研究的1 min HFS反映了短刺激期神经元的动态响应，为闭环刺激的研究提供了重要信息.总之，本文有关轴突刺激、去同步作用和动态响应的研究结果对于揭示脑刺激机制、开发治疗脑疾病的新技术具有重要意义.