庞翠萍1,2，刘松1,2，周景文1,2，张国强1,2*，李江华2*

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡,214122) 2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

摘 要 脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶，在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX，并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35 ℃；最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的Kcat/Km较BtLOX高16.7倍，展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达，采取了2种优化策略：首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)，使胞内酶活力提高了1.53倍，可溶表达水平提高了2.41倍；进一步与触发因子(triggering factor, TF)融合表达，TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍，可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质及优化表达条件，为脂肪氧合酶的高效生产及应用提供了重要参考。

关键词 脂肪氧合酶；酶学性质；可溶表达；触发因子

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC. 1.13.11.12)属于脂质过氧化酶的异构家族，主要催化具有一个或多个cis,cis-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的特异性双加氧反应[1]，生成氢过氧化物，进一步转化为一系列具有生物活性的氧化脂类[2]。在食品加工领域，LOX可以介导小麦面筋中二硫键的形成，起到强筋、改善面团流变性的作用[3]。LOX也可与过氧化氢酶、异构酶和脱氢酶协同作用，增强水果和蔬菜的自然香气[4]。基于LOX开发的漂白剂和洗涤剂具有天然、温和、多效等特点[5]。此外，在制药行业中，LOX则可用于氯丙嗪的去除[6]。

现阶段，商业化的LOX主要来源于植物提取，但由于原料批次间成分不稳定及提取方法低效等问题，LOX导致成品质量不稳定，成本较高。随着生物技术的发展，微生物发酵生产LOX因其生产成本低，绿色高效而得到广泛的关注。常用的模式菌株Escherichia coli具有遗传背景清晰、生长周期短、培养成本低、产量高等优点，常被用作重组蛋白的表达宿主[7]。细菌来源的LOX在E.coli表达系统中具有高效表达的潜力。其中，Pseudomonas aeruginosa来源的LOX被研究的较多[8]，Burkholderia thailandensis来源的LOX因其能有效转化亚油酸为羟基不饱和脂肪酸等，用于化妆品防腐剂也被关注[5, 9]。目前，重组LOX存在表达量低、稳定性差等问题，限制了其工业化生产与应用。随着现代酶工程技术的发展，通过对不同来源LOX酶学性质的分析比较，利用分子改造与表达优化等策略将有利于实现LOX的高效异源表达。本研究通过构建重组E.coli分别表达P. aeruginosa与B.thailandensis来源的LOX并对其酶学性质比较分析，选择酶学性能优良的PaLOX进一步表达优化，提高其可溶性表达水平，为构建高效的LOX表达系统奠定了基础。

1.1.1 菌株和质粒

本研究所用质粒与菌株见表1。

1.1.2 试剂

DNA聚合酶、DNA连接酶、E. coli感受态,TaKaRa公司；ClonExpress®Ⅱ One step Cloning Kit试剂盒,南京诺唯赞公司;质粒提取试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)等,生工生物工程(上海)股份有限公司；亚油酸,麦克林(上海)公司。所有化学试剂均为国产分析纯。

表1 研究所用质粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this work

质粒/菌株相关性质来源或参考文献质粒pET-22b(+)表达质粒;氨苄抗性实验室保存pCold-TF表达质粒;氨苄抗性;携带触发因子(TF)实验室保存pET-22b(+)/PaloxpET-22b(+) 携带Palox基因实验室保存[8]pET-22b(+)/BtloxpET-22b(+) 携带Btlox基因本研究构建pCold-TF/PaloxpCold-TF携带Palox基因本研究构建菌株E. coli JM109克隆宿主,用于质粒构建实验室保存E. coli BL21(DE3)表达宿主,用于PaLOX和BtLOX的表达实验室保存

1.1.3 培养基和缓冲液

LB(Luria-Bertani)培养基(g/L)：酵母粉5、胰蛋白胨10、NaCl 10、自然pH。

TB(Terrific-broth)培养基(g/L)：酵母粉24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO4 2.31、K2HPO4·3H2O 16.43、pH 7.0。

固体培养基在此基础上添加质量分数为1.5%～2%的琼脂粉。

缓冲液A：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.5。

缓冲液B：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，500 mmol/L咪唑，pH 7.5。

1.2.1 质粒构建

基于E.coli密码子偏好性优化合成Btlox基因(序列号：YP_442874.1)。为便于纯化，设计引物F1、R1(见表2)在N端引入组氨酸标签，PCR扩增得到Btlox片段。质粒pET-22b(+)经BamH I和Hind III双酶切后得到载体pET-22b(+)的线性化片段。经重组、转化即得到表达载体pET-22b(+)/Btlox。

表2 质粒构建过程中所用引物Table 2 Primers used in the construction of plasmids

引物名称引物序列F1GTGCGGCCGCAAGCTTTCAGATGTTAGTAGAAGCAGGGATACGF2CGAAGGTAGGCATATGATGCATCATCATCATCATCATGCAGAAGCR1GAGATATACATATGATGCATCATCATCATCATCATGTTAACCATAAAACTGR2GCAGGTCGACAAGCTTTCAGATATTGGTGCTCGCCGGGATAC

质粒pCold-TF经BamH I和Hind III双酶切后得到载体pCold-TF的线性化片段。利用引物F2、R2(见表2)扩增得到目的基因Palox片段,经重组、转化得到表达载体pCold-TF/Palox。引物、基因合成与DNA测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 重组LOX的表达

将各株重组甘油菌划线于LB固体培养基中，37 ℃条件下培养12 h，单菌落接种于装有10% LB培养基的250 mL 摇瓶中，37 ℃，220 r/min条件下培养8～10 h。按4%的接种量接入装有10% TB培养基的250 mL摇瓶中，于37 ℃，220 r/min条件下培养至菌体密度(OD600)达到0.5～0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，20 ℃诱导培养24 h。以上培养过程均需添加100 μg/mL氨苄青霉素以维持质粒稳定及防止杂菌污染。

1.2.3 重组LOX的纯化

利用镍柱亲和层析的方法对LOX蛋白进行分离纯化。具体过程如下：不同重组菌的发酵液及细胞提取物均在4 ℃,14 000 r/min下离心15 min取上清液，并用0.22 μm的混合纤维素膜过滤除杂。将样品上样于已用缓冲液A预平衡的镍亲和层析柱中，待再次平衡后，用8%缓冲液B洗脱杂蛋白。用20%缓冲液B洗脱目标LOX，随后于预冷的缓冲液A中在4 ℃环境下透析获得纯蛋白。

1.2.4 菌体浓度OD600值的测定

发酵液用缓冲液A稀释相应倍数后，检测600 nm下的吸光值，以OD600值表示。OD600值与菌体干重之间的换算关系为当OD600值为1时，菌体质量浓度为0.578 g/L，可以计算出相应OD600值所对应的菌体干重。

1.2.5 LOX酶活力的测定

LOX的酶活力检测方法根据STEFAN[10]的方法进行了改进。酶活力测定条件：亚油酸在缓冲液A中稀释至终浓度0.32 mmol/L，将200 μL亚油酸底物缓冲液与20 μL稀释的LOX酶液混匀，25 ℃孵育4 min。每隔10 s向混合物中添加10 μL 10 mg/mL可溶性淀粉和40 μL饱和碘化钾溶液。最后，添加500 μL 体积分数15.0%的乙酸溶液显色10 min，测定470 nm下的吸光值。在所有的实验中，以失活LOX作为空白对照。单位LOX酶活力定义：1 min内470 nm下的吸光值增加0.001即为1个酶活力单位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE电泳及蛋白浓度检测

10%的NuPAGE® SDS-PAGE蛋白胶用于分析蛋白的表达水平，以2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液为电泳缓冲液，上样量为15 μL，电泳电压为120 V。采用Brandford方法[11]测定蛋白浓度。

1.2.7 LOX最适反应温度和热稳定性的测定

最适反应温度：将溶有底物的缓冲液A分别在20～60 ℃的条件下孵育10 min，在不同温度下测定LOX酶活力，以酶活力最高者为100%。

热稳定性：重组LOX的热稳定性用30 ℃和50 ℃下酶活力的半衰期(t1/2, min)来表示。将纯酶用缓冲液A稀释到100 μg/mL，在不同温度下保温，间隔5 min取样测定残余酶活力，将残余酶活力按照文献所述方式拟合并计算半衰期(t1/2, min)[12]。

1.2.8 LOX最适反应pH和pH稳定性的测定

最适反应pH：分别用浓度为20 mmol/L的CH3COOH-CH3COONa (pH 3～6)、K2HPO4-KH2PO4 (pH 6～8)、C2H5 NO2-NaOH (pH 8～11)的缓冲液配制底物，测定纯酶在不同pH下的酶活力，将最高酶活力值定义为100%，采用非线性回归拟合曲线。

pH稳定性：将纯酶液用上述不同pH缓冲液稀释至100 μg/mL，在25 ℃下放置1 h，测定残余酶活力，以未保温酶液的酶活力为100%，采用非线性回归拟合曲线。

1.2.9 金属离子对酶活力的影响

将纯酶在pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析以置换缓冲液A。在底物中分别添加终浓度为0.1 mol/L和1 mol/L的一价(Li+、Na+)、二价金属离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，测定添加金属离子后纯化酶的酶活力，以无任何添加物下的酶活力为100%。

1.2.10 底物促溶剂对酶活力的影响

在缓冲液A中分别添加体积分数为2%和6%的有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、二甲基亚砜)促进底物在缓冲液内分散，测定添加底物促溶剂后纯酶的酶活力，以无任何添加条件下的酶活力为100%。

1.2.11 LOX的动力学常数测定

用缓冲液A配制不同浓度(0.02～0.2 mmol/L)的亚油酸底物溶液，在25 ℃下分别测定LOX催化不同浓度亚油酸生成氢过氧化物的速率，采用非线性回归拟合计算Km和Kcat。

通过MEGA 6.06软件对12种来源的LOX基因序列进行分析，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，通过Kimura 2-Parameter Distance模型计算进化距离。如图1所示，来源于P. aeruginosa PA01和B. thailandensis E264的LOX进化距离接近。结合前期研究报道(见表3)，来源于P. aeruginosa、B. thailandensis的LOX的底物亲和力相对其他原核细菌来源的高，具有较大的开发潜力。因此，我们选取来源于P. aeruginosa和B. thailandensis的LOX基因进行异源表达，并比较分析其酶学性质。

为研究LOX的表达情况，分别在E.coli BL21(DE3)中构建表达PaLOX、BtLOX的重组质粒pET-22b(+)/Palox、pET-22b(+)/Btlox(图2-a)，并在20 ℃条件下诱导表达。

图1 LOX的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree on the basis of LOXs

表3 LOX酶学性质分析Table 3 Comparison of LOXs properties from different sources

基因来源底物Km/(mmol·L-1)Kcat/(s-1)Kcat/Km/[L·(mmol·s) -1]最适温度/℃最适pH 参考文献P. aeruginosa亚油酸4.9×10-2NRNR257.5[13]B. thailandensis花生四烯酸9.8×10-21.1×1021.2×103亚油酸4.2×10-29.4×102.3×103257.5[14]Cucumis melo var. makuwa (CmLOX10)亚油酸2.3×10-15.5×1032.4×104355.0亚油酸1.4×10-12.4×1031.7×104[15]Cucumis melo var. makuwa (CmLOX13)亚油酸1.3×10-12.4×1031.9×104455.5亚油酸1.6×10-11.8×1031.2×104Pleurotus sapidus亚油酸4.0×10-21.6×1023.9×103357.0[16]Pleurotus ostreatus亚油酸1.3×10-12.6×102.0×102256.5[17]Magnaporthe salvinii亚油酸1.0×10-3NRNR507.0[2]花生四烯酸5.5×10-1Myxococcus. xanthus花生四烯酸1.7×10-11.911308.5[18]亚油酸3.8×10-19.224

注：NR文献未报道

a-LOX表达式质粒；b-SDS-PAGE电泳分析图 M-蛋白质标准分子量；箭头表示PaLOX和BtLOX蛋白条带图2 构建的LOX表达质粒和Palox、Btlox 表达蛋白SDS-PAGE电泳分析图Fig.2 Construction of LOX expression plasmid and SDS-PAGE analysis of the expressed Palox and Btlox

通过蛋白表达分析发现，PaLOX、BtLOX在胞内可溶和不溶部分均有明显条带，其大小约为70 kDa。而BtLOX胞外未见重组蛋白条带(图2-b)。LOX活性结果显示，PaLOX发酵上清液LOX酶活力为351 U/DCW(Units per Dry Cell Weight)，胞内为726 U/DCW；BtLOX胞内酶活力为597 U/DCW。上述结果表明，Palox和Btlox基因在E. coli中均实现了可溶表达，与以往研究报道[13]不一致的是，BtLOX表达过程中产生了大量的包涵体，可能是由于诱导温度高于16 ℃所致。

为评估LOX的应用潜力，对LOX的最适反应温度和热稳定性进行了比较分析。结果表明，重组PaLOX和BtLOX的最适反应温度分别为25和35 ℃(图3-a)。随着反应温度的不断升高，当反应温度超过50 ℃时，2种来源的LOX活力均显著降低，但BtLOX活性下降较PaLOX明显。进一步研究LOXs的热稳定性发现，在30 ℃的条件下孵育，PaLOX和BtLOX的酶活力下降趋势缓慢，t1/2分别为59 min和157 min。在50 ℃的条件下孵育，随着时间的延长，二者活力下降趋势均较明显，PaLOX和BtLOX的t1/2分别为7 min和5 min(图3-b)。上述结果表明，30 ℃条件下重组BtLOX的稳定性较PaLOX好，而在50 ℃条件下则较PaLOX差。

a-最适反应温度；b-不同温度下的热稳定性图3 温度对LOX催化活性及稳定性的影响Fig.3 Effects of temperature on the catalytic efficiency and stability of LOX

为了评估pH对LOX的影响，测定了pH在3.0～11.0之间LOX的酶活力变化。结果显示，重组PaLOX和BtLOX的最适反应pH分别为7.0和7.5，pH值>8.0或10.0时，LOX的催化活性基本完全丧失(图4-a)。对LOX的pH稳定性进行分析，结果表明重组PaLOX在pH 6.0～10.0之间均较BtLOX稳定，而在pH

a-不同pH条件下LOX的催化活性； b-不同pH条件下LOX的稳定性图4 pH对LOX酶活力及稳定性的影响Fig.4 Effects of pH on the catalytic efficiency and stability of LOX

对酶有激活作用的激活剂，能在酶与底物之间形成一种酶-金属离子-底物的三元复合物，有利于底物与酶的活性中心结合；而对酶活力有抑制作用的，则可作为酶的抑制剂。因此，实验研究了金属离子对2种LOX酶活力的影响(图5)。其中Mg2+和Na+对PaLOX和BtLOX有激活作用，Cu2+、Zn2+对二者有明显的抑制作用。值得注意的是，低浓度的Fe2+对BtLOX有激活作用，而对PaLOX则有抑制作用。

a-金属离子对BtLOX活性的影响； b-金属离子对PaLOX活性的影响图5 金属离子对LOX催化活性的影响Fig.5 Effect of metal ions on catalytic activity of LOX

酶和底物之间的结合能力是酶催化反应的主要推动力，其中底物的溶解度是直接影响酶和底物结合的因素。通过比较不同底物促溶剂对LOX酶活力的影响，发现体积分数为2%的甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇和丙酮对PaLOX的酶活力影响不大。在体积分数为6%下，PaLOX酶活力受到了抑制，可能是高浓度的有机溶剂使部分酶失活所致。体积分数为2%和6%的甲醇、乙醇、乙二醇对BtLOX酶活力均有不同程度的提高，特别是甲醇和乙二醇能显著提高40%的酶活力，可能是由于甲醇和乙二醇改善了底物亚油酸的溶解度，进而提高了BtLOX的酶活力(图6)。AN等[14]曾报道体积分数为6%的甲醇可以作为底物促溶剂有效改善LOX的催化效率。

a-促溶剂对PaLOX酶活力的影响；b-促溶剂对BtLOX酶活力的影响 1-甲醇;2-乙醇;3-乙二醇;4-丙酮;5-异丙酮;6-二甲基亚砜图6 促溶剂对LOX催化活性的影响Fig.6 Effect of dissolvant on catalytic activity of LOX

酶的动力学参数是评价酶与底物的亲和力及催化活性的重要指标。据报道，野生型PaLOX以亚油酸为底物的Km值为660 μmol/L[19]，而进行重组表达后，Km值则为48.9 μmol/L[8]，表明重组表达有利于提高PaLOX对底物的亲和力。因此，分析比较了重组PaLOX和BtLOX在不同亚油酸浓度下的酶促动力学参数(表4)。结果表明，以亚油酸作为底物时，重组表达的PaLOX的底物亲和力较BtLOX高14.9倍； Kcat/Km较BtLOX高16.7倍。因此，PaLOX在底物亲和力、催化效率以及表达效果上优势明显，具有更好的开发应用潜力。

表4 LOX酶动力学参数Table 4 LOX kinetic parameters

酶种类Km/(mmol·L-1)Vmax/(U·min-1)Kcat/(s-1)Kcat/Km/[L·(mmol·s)-1]PaLOX6.4×10-2196.5×1031.0×105BtLOX4.3×10-1122.6×1036.0×103

如何提升外源蛋白高效、可溶表达是工业酶生产与应用的瓶颈。前期研究也发现，虽然2种细菌来源的LOX均能异源表达，但表达过程中存在着大量的包涵体，可溶表达水平较低。为进一步实现LOX的高效可溶表达，选择可溶性表达与应用潜力较好的PaLOX，通过设计不同浓度的IPTG和乳糖的组合添加，进行表达条件优化。结果表明，随IPTG浓度的降低，乳糖浓度的增加，PaLOX的酶活力在不断增加。当单独使用乳糖作为诱导剂时，PaLOX酶活力较IPTG作为诱导剂时提高了1.53倍，可溶表达水平提高了2.41倍，不可溶部分也提高了1.29倍(图7)。虽然更换诱导剂可以大幅提高PaLOX的表达水平与酶活力，但未能完全解决包涵体问题。

1-1 mmol/L IPTG;2-0.8 mmol/L IPTG+0.56 mmol/L乳糖; 3-0.6 mmol/L IPTG+1.11 mmol/L乳糖;4-0.4 mmol/L IPTG+ 1.67 mmol/L乳糖;5-0.2 mmol/L IPTG+2.22 mmol/L 乳糖;6-2.78 mmol/L乳糖图7 不同浓度IPTG和乳糖浓度组合对LOX活性 和表达水平的影响Fig.7 Effect of combination of IPTG and lactose concentration on LOX activity and expression level

在重组蛋白的表达过程中，合适的载体和分子伴侣对重组蛋白的正确折叠，防止包涵体的形成具有积极作用[20]。触发因子(triggering factor，TF)是一种来源于E.coli的核糖体结合伴侣蛋白，是第1个与新生多肽链相互作用并协助蛋白质共翻译折叠的伴侣[21]，可有效促进蛋白的可溶表达。因此，构建了分子伴侣TF融合表达质粒pCold-TF/Palox(图8-a)，分析TF对PaLOX可溶表达的影响。结果表明，TF-PaLOX融合酶活力较PaLOX提高了1.85倍，达到4520 U/DCW(图8-b)。SDS-PAGE分析显示，胞内不溶部分基本消失，可溶表达水平提高了3.19倍(图8-c)。与其他来源的标签相比，TF表达效率高，可溶性效果好，能有效促进PaLOX的可溶表达，具有重要的应用价值。

a-pCold-TF/lox表达质粒示意图；b-胞内LOX活性分析；c-SDS-PAGE电泳分析 M-蛋白质标准相对分子质量；1,2-TF-PaLOX的SDS-PAGE分析；3,4-PaLOX的SDS-PAGE分析；其中1,3-胞内可溶部分；2,4-胞内不溶部分图8 TF对LOX表达的影响Fig.8 Effect of TF on LOX expression

由于LOX在食品、医药、造纸等领域有着广泛的应用，研究者对其进行了大量研究，包括从天然酶的分离提取[22-23]到LOX异源表达与分子改造等[17, 24]。到目前为止，已经有大量来自植物[25]、动物[26-27]和真菌[16, 24]等的LOX基因被克隆并成功表达。本研究以原核细菌来源的P. aeruginosa、B.thailandensis LOX基因为研究对象，通过将其在E.coli中异源表达，比较酶学性质，并利用优化诱导剂及分子伴侣融合表达策略，最终实现了LOX在E.coli表达系统中的高效可溶性表达。实验结果表明,TF作为促折叠的分子伴侣，通过与未折叠的蛋白结合，有效促进LOX的可溶表达。另外，TF催化肽基脯氨酰键的顺反异构化，可能也有利于改善蛋白质折叠过程中的限速步骤[21]。

目前研究表明，细菌来源的LOX的最适反应温度和热稳定性较其他来源的LOX差，限制了其工业应用。已有对LOX热稳定性研究的报道，例如通过在LOX的N-端和C-端的loop结构域(L6)插入1～3个L6序列[28]，或融合双亲短肽[8]，以及高柔性loop区域改造[29]等策略，可有效提高其热稳定性。因此，在后期研究中，进一步利用理性改造、定向进化等策略进行LOX分子改良，并结合高效的蛋白表达系统，将有利于实现LOX的高效生物合成，有效拓展LOX的工业应用范围。

参考文献

[1] ELLEN H, SUSAN K, ALENA L, et al. Identification of an amino acid determinant of pH regiospecificity in a seed lipoxygenase from Momordica charantia [J]. Phytochemistry, 2008, 69(16): 2 774-2 780.

[2] ANON. Evolution and expansion of the prokaryote-like lipoxygenase family in the brown alga Saccharina japonica [J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 2 018.

[3] RODCASEY, HUGHES R K J F B. Recombinant lipoxygenases and oxylipin metabolism in relation to food quality [J]. Food Biotechnology, 2004, 18(2): 135-170.

[4] CASEY R, WEST S I, HARDY D, et al. New frontiers in food enzymology: Recombinant lipoxygenases [J]. Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(9): 297-302.

[5] ZHANG C, TAO T, YING Q, et al. Extracellular production of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 in Bacillus subtilis and its effect on wheat protein [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(4): 949-958.

[6] SANTANO E, PINTO M D C, PEDRO M. Chlorpromazine oxidation by hydroperoxidase activity of covalent immobilized lipoxygenase [J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2002, 36(2): 95-100.

[7] MAHALIK S, SHARMA A K, MUKHERJEE K J. Genome engineering for improved recombinant protein expression in Escherichia coli [J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 177.

[8] LU X, LIU S, ZHANG D, et al. Enhanced thermal stability and specific activity of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase by fusing with self-assembling amphipathic peptides [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(21): 9 419-9 427.

[9] KATERYNA G, SABINE S, DAGMAR H, et al. Functional characterization of a novel arachidonic acid 12S-lipoxygenase in the halotolerant bacterium Myxococcus fulvus exhibiting complex social living patterns [J]. Microbiology Open, 2019, 8(7): e775.

[10] STEFAN H, TERTIUS C, PIETER S. Lipoxygenases: From isolation to application [J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2017, 16(1): 199-211.

[11] RUSSELL R J, GERIKE U, DANSON M J, et al. Structural adaptations of the cold-active citrate synthase from an Antarctic bacterium [J]. Structure, 1998, 6(6): 351-361.

[12] CIARN ’ FGIN. Enzyme stabilization—recent experimental progress [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(2): 137-149.

[13] LU X, ZHANG J, LIU S, et al. Overproduction, purification, and characterization of extracellular lipoxygenase of Pseudomonas aeruginosa in Escherichia coli [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(13): 5 793-5 800.

[14] AN J U, KIM B J, HONG S H, et al. Characterization of an omega-6 linoleate lipoxygenase from Burkholderia thailandensis and its application in the production of 13-hydroxyoctadecadienoic acid [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(13): 5 487-5 497.

[15] CAO S, CHEN H, ZHANG C, et al. Heterologous expression and biochemical characterization of two lipoxygenases in oriental melon, Cucumis melo var. makuwa Makino [J]. Plos One, 2016, 11(4): e0153801.

[16] KELLE S, ZELENA K, KRINGS U, et al. Expression of soluble recombinant lipoxygenase from Pleurotus sapidus in Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Puripication, 2014, 95: 233-239.

[17] TASAKI Y, TOYAMA S, KURIBAYASHI T, et al. Molecular characterization of a lipoxygenase from the basidiomycete mushroom Pleurotus ostreatus [J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2013, 77(1): 38-45.

[18] HUI Q, BINGJIE X, YUJUN H, et al. Expression, purification, and characterization of a novel acidic Lipoxygenase from Myxococcus xanthus [J]. Protein Expres. Purif., 2017, 138: 13-17.

[19] VIDAL-MAS J, BUSQUETS M, MANRESA A. Cloning and expression of a lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa 42A2 [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2005, 87(3): 245-251.

[20] BALCHIN D, HAYER-HARTL M, HARTL F U. In vivo aspects of protein folding and quality control [J]. Science, 2016, 353(6 294): aac 4354.

[21] KRAMER G, PATZELT H, RAUCH T, et al. Trigger factor peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity is not essential for the folding of cytosolic proteins in Escherichia coli [J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(14): 14 165-14 170.

[22] SHARMA B, CHUGH L K. Two isoforms of lipoxygenase from mature grains of pearl millet [Pennisetum glaucum (L.) R. Br.]: Purification and physico-chemico-kinetic characterization [J]. Journal of Food Science & Technology, 2017, 54(6): 1 577-1 584.

[23] 王卫东, 杨万根, 付湘晋. 白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶的分离纯化与鉴定 [J]. 食品科学, 2010, 31(23): 164-166.

[24] AKIKO S, HENRIK S L, KENJI M, et al. Characterization of two fungal lipoxygenases expressed in Aspergillus oryzae [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2018, 126(4): 436-444.

[25] EGMOND M R, BRUNORI M, FASELLA P M. The steady-state kinetics of the oxygenation of linoleic acid catalysed by soybean lipoxygenase [J]. European Journal of Biochemistry, 2010, 61(1): 93-100.

[26] JIN G, ZHANG J, YU X, et al. Crude lipoxygenase from pig muscle: Partial characterization and interactions of temperature, NaCl and pH on its activity [J]. Meat Science, 2011, 87(3): 257-263.

[27] KUHN H, WALTHER M, KUBAN R J. Mammalian arachidonate 15-lipoxygenases-Structure, function, and biological implications [J]. Prostaglamdins & Other Lipid Mediators, 2002, 68-69: 263-290.

[28] 王广圣,徐智,刘松,陈坚,堵国成.重组脂肪氧合酶分子改造[J].食品科技,2014,39(9):2-7.

[29] LU X, LIU S, FENG Y, et al. Enhanced thermal stability of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase through modification of two highly flexible regions [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(4): 1 663-1 669.

PANG Cuiping1,2, LIU Song1,2, ZHOU Jingwen1,2, ZHANG Guoqiang1,2*,LI Jianghua2*

1(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract Lipoxygenase (LOX) is a kind of oxidoreductase containing non-heme iron in the active center, which is used in food, medicine and chemical industry. In our study, we first constructed recombinant Escherichia coli BL21(DE3) to express PaLOX and BtLOX from Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia thalandensis, respectively, and compared their enzymatic properties. Enzymatic analysis showed that the optimum reaction temperature of recombinant PaLOX and BtLOX was 25 ℃ and 35 ℃, respectively. Their optimum reaction pH was 7 and 7.5. Furthermore, the Kcat/Km of PaLOX was 16.7 times higher than BtLOX and showed potential for industrial application. To improve soluble expression of PaLOX, the IPTG inducer was replaced with lactose, which increased the activity of intracellular LOX enzyme by 1.53 times, and the expression level of soluble protein was 2.41 times higher. Next, the activity of LOX increased 1.85 times and the level of soluble expression increased 3.19 times by fusion expressed LOX with triggering factor. These results provided an important reference for the efficient production and application of LOX.

Key words lipoxygenase; enzymatic properties; soluble expression; triggering factor

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024233

引用格式:庞翠萍，刘松，周景文，等.细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化[J].食品与发酵工业,2020,46(19):1-8.

PANG Cuiping, LIU Song, ZHOU Jingwen, et al. Characterization and expression optimization of lipoxygenase from bacteria[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(19):1-8.

第一作者：博士研究生(张国强副研究员和李江华教授为共同通讯作者，E-mail: [email protected]； [email protected])

基金项目：国家自然科学基金项目(31771913)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(JUSRP52026A)

收稿日期：2020-04-17，改回日期：2020-05-20