胶原蛋白（Collagens）是人体最富集且非常重要的蛋白，其最常见形式为I型、II型、III型、IV型和V型。

   胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，可以促进细胞粘附和迁移。

   胶原蛋白可以细分为六种不同的类别：纤维状胶原蛋白、网络形成胶原蛋白、具有间断三螺旋 (FACIT) 胶原蛋白的纤维     相关胶原蛋白，跨膜胶原蛋白、复合蛋白和其他胶原蛋白。

   每个胶原蛋白分子由三个α-链组成，它们形成均质或异质三螺旋启动子组装成具有不同功能的超分子结构。

   胶原蛋白主要存在于骨骼、皮肤、以及结缔组织（多为I型胶原蛋白）、软骨（多为II型胶原蛋白）和血管（多为III型胶       原蛋白）中。

   XXV型、XIII型、XVII型和XXIII型胶原蛋白为跨膜蛋白。

   胶原蛋白I（图二）、胶原蛋白II和胶原蛋白III（图三）均表达于细胞外基质中。

   胶原蛋白的提取通常有以下三种方法，其中酶促提取最为有效（图四）：

     盐沉淀提取 - 通过在中性盐溶液中逐渐加入氯化钠提取。（例如：0.45M NaCl，在搅拌条件下于 pH 7.5 保持 24 小         时）

     酸提取 - 在有机酸如乙酸中提取（例如：0.5M 醋酸，在 pH 2.5 下保持 24 小时）

     酶提取 - 在有机酸中，添加胃蛋白酶提取（例如：0.5M 醋酸中的 0.1% (w/v) 胃蛋白酶，在 pH 2.5 下保持 48 小时）

我们推荐通过胃蛋白酶提取胶原蛋白，因为它可以去除胶原蛋白的非螺旋末端并增加胶原蛋白溶解度，从而提高提取效率。

   除此之外，Collagen蛋白提取还须注意：

     胶原蛋白不溶于有机溶剂，大部分不溶于水。

     胶原蛋白对温度敏感：在4℃/冰上进行提取，可防止胶原蛋白因三螺旋解开而降解。

     酸性pH值对胶原蛋白的溶解至关重要，并且酸性环境可以有效避免胶原蛋白发生聚合。

     避免因胶原蛋白浓度过高而引起聚合现象发生。

   由于胶原蛋白比其他蛋白质更不稳定，所以WB实验应在 4⁰C/冰上进行。

   对于Collagen I蛋白检测（图五），请使用6%丙烯酰胺凝胶，因为其分子量较大。

   对于Collagen IV、V 和VI，使用10% 的丙烯酰胺凝胶。或者，也可以选择梯度凝胶。

   向样品中添加4M尿素可改善电泳过程中胶原蛋白的分离。

   我们建议使用3% BSA进行封闭，并使用PVDF膜进行转膜及后续操作。

   由于不同类型胶原蛋白，其交联可能会有很大差异，所以选择合适的抗原修复方法暴露其表位非常重要。

   剧烈的抗原修复条件可能会破坏胶原蛋白的三级结构。 我们建议使用pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，也可以       尝试使用酶抗原修复方法。

   如需观察胶原蛋白的三级结构，建议使用冰冻切片(IHC-Fr)进行组化实验。

   Picro Sirius Red (ab150681) 可与纤维状胶原蛋白（I-V型）上的 [gly-X-Y]n螺旋结构结合，因此可用于确定胶原蛋白       交联的程度（图六）。

   胶原蛋白作为高度保守的蛋白质，其特征在于不间断的甘氨酸-X-Y三联体重复序列，赋予它们三重螺旋结构。不同胶原     蛋白类型的这种三螺旋结构的密切相似性使得制备识别于特定类型胶原蛋白的抗体变得非常困难。

   为了使胶原蛋白抗体具有特异性，用于抗体制备的免疫原必须依赖于未变性的三维胶原表位或仅在特定类型胶原中发现     的较短肽序列。请根据您需要检测的胶原蛋白类型，选择合适的抗体并相应地调整实验方案。

   如果您使用的是使用短肽序列（例如ab138492）开发的胶原蛋白抗体，则无需如此小心地保持胶原蛋白3D结构。我们     所有的RabMAb®胶原蛋白抗体（例如用于胶原蛋白I的 ab260043）均使用对目标胶原蛋白具有特异性序列的合成短       肽制成。

胶原蛋白

结构

分布

I

纤维状

广泛

II

纤维状

软骨、玻璃体

III

纤维状

皮肤、血管、肠

IV

网状

基底膜

V

纤维状

广泛

VI

网状

广泛

VII

锚原纤维

真皮、膀胱

VIII

网状

广泛

IX

FACIT

软骨、角膜、玻璃体

X

网状

软骨

XI

纤维状

软骨、椎间盘

XV

FACIT

基底膜

XVII

MACIT

上皮细胞中的半桥粒

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