聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PA

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。③对pH和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。

PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。

除了常用的聚丙烯酰胺圆盘及垂直板电泳，还有聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及双向电泳等技术，这些技术在凝胶聚合方面有共同之处，但又有各自的特点，分别叙述如下。

一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性

1．聚合反应

聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵或核黄素作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶，其单体及聚合物化学结构式如下图所示。

聚合反应时常用的催化剂有过硫酸铵及核黄素两个系统。在水溶液中，过硫酸胺离子S2O2-8可形成游离基SO2-4，它能使丙烯酰胺单体的双键打开，形成游离基丙烯酰胺，后者和Bis单体作用，能聚合成凝胶。

催化反应需要在碱性条件下进行，如用7%的丙烯酰胺，在pH8.3时，30min就能聚合完毕。为避免溶液中有氧气而妨碍聚合，在反应前有必要将溶液抽气除氧。核黄素在光照下部分分解并被还原成无色型核黄素；但在有氧的条件下此无色型又被氧化成为带有游离基的核黄素，后者也能使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成凝胶。为加速聚合，在合成过程中还加四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂促进聚合作用。

聚丙烯酰胺凝胶因富含酰胺基，使凝胶具有稳定的亲水性。它在水中无电离基团，不带电荷，几乎没有吸附及电渗作用，是一种比较理想的电泳支持物。

2．凝胶孔径的可调性及其有关性质

（1）凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。通常用T%表示总浓度，即100ml凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数。Acr和Bis的比例常用交联度C%表示，即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数。

根据有关实验研究，可知当T%值固定时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%时，孔径却相应变大。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。

要想将蛋白质或核酸之类的大分子混合物很好地分离，并在凝胶上形成明显的区带，选择一定孔径的凝胶是个关键。常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。

（2）凝胶浓度与被分离物分子量的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同，其大致范围如表3-3。

在操作时，可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶（标准胶），因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。

表3-3>>>分子量范围与凝胶浓度的关系

分子量范围

适用的凝胶浓度（%）

蛋白质

＜104

1—4×104

1—5×104—1×105

1×105

＞5×105

>

20—30

15—20

10—15

5—10

2—5

核酸（RNA）

＜104

104—105

105—2×106

>

15—20

5—10

2—2.6

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis，简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统2大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳（disc electrophoresis），其装置如图3-4；后者，凝胶是在2块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为板状电泳（slab electrophoresis）。两者电泳原理完全相同。现以R.J.Davis等（1964）用高pH不连续圆盘PAGE分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。

不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管中（或2层玻璃板中）排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶，如示意图3-5。

样品胶是聚合成为的大孔胶，T=3%，C=2%，其中含有一定量的样品及pH6.7的Tris-HCl凝胶缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。

实际上，浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。

分离胶是聚合成的小孔胶，T=7.0~7.5%，C=2.5%，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl，大部分血清中各种蛋白质在此pH条件下，按各自负电荷量及分子量泳动。此胶主要起分子筛作用。

上、下电泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙烯酸制作的。将带有3层凝胶的玻璃管垂直放在电泳槽中，在两个电极槽倒入足够量pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液，接通电源即可进行电泳。在此电泳体系中，有2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值，因而形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。下面就这三种物理效应的原理，分别加以说明。

1．样品浓缩效应

（1）凝胶孔径不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶T=3%为大孔胶；分离胶T=7%或7.5%为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

（2）缓冲液离子成分的不连续性：电泳液中含甘氨酸离子，pH为8.3；样品层及浓缩胶层中含氯离子，pH6.7；分离胶层中亦含氯离子，pH为8.9时，甘氨酸的解离度（a）较小，其有效迁移率（即迁移率×解离度）亦较小，故甘氨酸常被称作慢离子（或随后离子、结尾离子）。盐酸是全部离解的，其有效迁移率最大，常被称作快离子（或先导离子、先行离子等）。而在pH6.7时，蛋白质的有效迁移率介乎于上面两者之间。

电泳开始后凝胶中氯离子、甘氨酸负离子、样品蛋白质离子都向正极移动，而且它们的有效迁移率（迁移率乘以离解度为有效迁移率）按以下次序排列：氯离子＞蛋白质阴离子＞甘氨酸阴离子浓缩胶中氯离子（称快离子），很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。因为，电位梯度（E）与电导率成反比，所以低电导区有较高的电位梯度，这就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子（称慢离子）在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐地被压缩，聚集成一条狭窄的起始区带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。不连续电泳浓缩效应如图3-6所示。

2．分子筛效应

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。

经上述浓缩效应后，快、慢离子及蛋白质均进入pH8.9的同一孔径的分离胶中。此时，高电压消失，在均一的电压梯度下，由于甘氨酸解离度增加，加之其分子量小，则有效泳动率增加，赶上并超过各种血清蛋白。因此，各种血清蛋白进入同一孔径的小孔胶时，则分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关，分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于凝胶柱色谱中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。

3．电荷效应

虽然各种血清蛋白在浓缩胶与分离胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭窄的高浓度蛋白区，但进入pH8.9的分离胶中，各种血清蛋白所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个圆盘状的区带，因而称为圆盘电泳。

目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性，而常为科学工作者所采纳。

聚丙烯酰胺垂直板电泳是在圆盘电泳的基础上建立的，两者电泳原理完全相同，只是灌胶的方式不同，凝胶不是灌在玻璃管中，而是灌在嵌入橡胶框凹槽中长度不同的2块平行玻璃板的间隙内。且间隙可调节，一般有0.5mm，1.5mm及3mm 3种规格的橡胶框，前2种多用于分析鉴定，后一种常用于制备。垂直板电泳较圆盘电泳有更多的优越性：

（1）表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。

（2）在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。

（3）胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。

（4）胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。

（5）可进行双向电泳

血清蛋白在纸或醋酸纤维薄膜电泳中，只能分离出5~6条区带，而上述2种形式的聚丙烯酰电泳却可分离出数十条区带，因而，目前PAGE已广泛用于科研、农、医及临床诊断的分析、制备，如蛋白质、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分离及病毒、细菌提取液的分离等。

三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用它所形成孔径不同引起的分子筛效应，可将蛋白质分开。也可在整个电泳体系加入十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sμlfate简称SDS），则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS-PAGE。

用SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理：SDS是阴离去污剂，在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与大多数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/1g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打断，因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述2种情况，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数有关。

进行SDS-PAGE时，可利用已知分子量蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。用此法测定蛋白质分子量具有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少（仅需一天），分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质分子量测定，还可用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。