方法与结果

黄连解毒汤中化学成分收集和活性成分筛选

以“Huanglian,” “Huangbo,” “Huangqin,” 和“Zhizi”在TCMSP数据库中查找黄连解毒汤各个中药所含化学成分，并以口服生物利用度（OB）>30和药物相似性（DL）>0.18为原则筛选活性化合物。最终收集到102个活性化合物。

活性成分靶点预测

BATMAN-TCM, STITCH和SwissTargetPrediction三个数据库筛选上述获得的活性化合物。其中BATMAN-TCM score ≥20 和adjusted p ≤0.05。SwissTargetPrediction严格限定物种为“人”和可能性（probability）大于0.6。STITCH限定限定物种为“人”和置信分数（confidence score）≥0.6。最终预测到符合上述的靶点458个。

肺炎相关基因/靶点收集

DrugBank、OMIM、TTD、CTD、GeneCards、NCBI Gene database和 DisGeNET等7个疾病数据库收集肺炎相关靶点信息。以关键词“pneumonia”搜索，最终分别在上述数据库中收集到63, 116, 15, 39, 44, 229和191靶点。删除重复后，最终收集到疾病靶点476个。

交集靶点

将活性成分靶点映射到肺炎相关靶点上，发现两者交集靶点有69个，对应的活性化合物有54个（图3）。

图3. 交集靶点韦恩图和活性成分和靶点网络

网络构建及可视化

作者共建立了4个网络：交集靶点-活性成分网络、疾病PPI网络、交集靶点PPI网络、中药-活性成分-核心靶点-疾病网络。图2B为交集靶点-活性成分网络。以度值（>=7）大小为原则，筛选网络中比较重要的活性化合物，发现槲皮素、吴茱萸次碱、谷甾醇、β-谷甾醇、藏花酸和豆甾醇等6个重要的活性化合物。

将上述肺炎相关靶点带入STRING数据库，以物种“人”和置信分数≥0.4为条件构建PPI网络，并将结果导入Cytoscape。图4为疾病PPI网络。其中TLR4, TNF,CXCLB, IL1B, IL17A, IL10, IL4, IL6, STAT3和ITGAM等10个基因度值最大。接着对肺炎PPI网络进一步分析，采用MCODE模块以score cutoff =0.2, k core=2, maximum depth = 100和degree cutoff=2为条件进行聚类分析。共得到16个，取分值最高的前5个聚类（图4B, 表1）。

上述交集靶点带入STRING数据库，以物种“人”和置信分数≥0.4为条件构建PPI网络，并将结果导入Cytoscape。图5为交集靶点PPI网络。其中节点越大，说明度值也越大。

作者还构建了中药-活性成分-核心靶点-疾病网络。网络共包含4种中药, 39个活性成分, 10个核心靶点和1种疾病。发现槲皮素、吴茱萸次碱、谷甾醇、β-谷甾醇、藏花酸和豆甾醇等6个活性化合物在网络节点较大，是比较重要的活性化合物。这与在交集靶点-活性成分网络中发现的一致。

图4. 肺炎PPI网络和聚类分析

表1. 肺炎PPI聚类分析相关信息

图5.交集靶点PPI网络及核心靶点筛选

图6. 中药-活性成分-核心靶点-疾病网络图

核心靶点筛选

将交集靶点PPI网络进一步分析，利用插件Cytohubba采用maximum neighborhoodcomponent (MNC)方法筛选，以MNC值最大的10个基因为本网络的核心靶点（图5）。结果提示IL1B, IL6, CCL2, MMP9, PTGS2, TNF, CRP, EGFR, TLR4等10个靶点的MNC值最大，其中TLR4, TNF, IL1B和IL6等4个靶点还是肺炎中比较重要的靶点。

生物学分析

生物学分析包括两方面：GO分析和KEGG通路富集分析。GO分析包括生物学过程（BP）、细胞组分(CC)和分子功能(MF)三个方面。R软件clusterProfiler进行分别对肺炎相关靶点和交集靶点进行生物学分析。其中肺炎涉及1,475 BPs, 99 MFs, 46 CCs和91 KEGG 信号通路(p≤ 0.05)，KEGG分析显示通路主要富集在细胞因子受体相互作用, 趋化因子信号通路和病毒蛋白与细胞因子及其受体相互作用。

图7显示的是肺炎相关靶点最显著的生物学分析结果。其中交集靶点共涉及1,730 BPs, 110 MFs, 53 CCs和88 KEGGs (p≤0.05)，信号通路主要富集在糖尿病并发症AGE–RAGE 信号通路，恰加斯病(美洲锥虫病)和TNF信号通路等。图8显示的是交集靶点最显著的生物学分析结果。

图7. 肺炎相关靶点生物学分析

图8. 交集靶点生物学分析

分子对接验证

RCSB PDB网站下载核心蛋白结构，活性成分构象下载自TCMSP，AutoDock 4.2.6去除水分子、配体、加极性氢和加电荷等处理，Discovery Studio进行分子对接。表2显示核心化合物和核心靶点之间分子对接的结果。表2显示核心活性成分与核心靶点之间的结合能大小。结果显示所有结合能都小于−5.0 kcal/mol，提示活性成分和核心靶点之间有较稳定的结合。图9显示的是核心活性成分和核心靶点之间的相互作用。结果显示活性成分和靶点之间存在多种相互作用，包括氢键等。

表2. 核心活性成分和核心靶点之间的结合能

图9. 核心活性成分和核心靶点分子对接图

综合以上，网络药理学要想学习还是比较简单的，比较重要的是学会如何合理的利用相关数据库和软件的使用。学好网络药理学的套路，你也可以轻松发SCI论文。

END

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