8）末次离心后，弃去上清，加入完全 RPMI 1640 培养液重悬细胞，充分混匀；

9）用白细胞计数液计数单个核细胞，根据实验所需，加入完全 1640培养液调整细胞浓度到所需要的浓度。

常见的组织类型：小鼠脾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑组织、肿瘤组织、人肿瘤组织、皮肤组织……

传统组织处理方法：

机械法：网搓法、研磨法

适用样本类型：脾脏、淋巴结、胸腺

网搓法

1、将300 目尼龙网扎在无菌的小烧杯上；

2、把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；

3、收集细胞悬液于离心管中， 1500rpm离心5min；

4、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

研磨法

1、先将组织剪成1-2mm大小组织块；

2、放入组织研磨器中，转动研棒，研至匀浆；

3、加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；

4、收获细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1500rpm离心5min；

5、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

酶解法：胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶

适用样本类型：肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、皮肤、肿瘤等；

操作步骤：

1、先将组织剪成泥状。

2 、用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用千消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酌工作浓度一般为 0. 1 %—0 . 5 % 。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0 . 25 %胶原酶，胶原酌对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用浓度为 0 . 1—0 . 3ug / ml ，用大于组织量30—50 倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在 37°C ，摇床上消化组织，消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶油作用 20—60 min，胶原酶需1—4h左右，一般还会加入DNA核酸内切酶。

3、消化完毕后，将细胞悬液通过200目孔径尼龙网过滤，以除掉未充分消化的组织；

4、已过滤的细胞悬液经1500rpm离心5min后，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

下表整理了人和小鼠常见的不同组织处理方法，并附上参考文献，此内容来源于Worthington：

贴壁细胞（adherent cells）:活体体内细胞当离体置于体外培养时大多数以贴壁方式生长，主要包括正常细胞（例如：成纤维细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、心肌细胞以及肝、肺、肾、乳腺、皮肤细胞等）和肿瘤细胞。

胰蛋白酶消化

胰蛋白酶：最常用，浓度一般0.25%-5%，37℃消化时间一般1-5min，用血清终止；

临床上常见的脱落细胞经过简单处理就能制备成单细胞悬液，用于后续实验，具体操作：

1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备：

（1）将食管拉网器上的细胞洗脱到10ml PBS液中， 1500rpm，5min离心后，再用PBS液洗2次，800rpm，离心2min，弃上清；

（2）再加入PBS液5ml，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（3）加少许PBS液混匀沉淀细胞，备用。

2、胸、腹水脱落细胞的制备

（1）抽取胸、腹水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；

（2）将底部10~20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min；

（3）再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（4）加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。

3、冲洗液细胞样品的制备

（1）用300~500ml生理盐水冲洗膀胱，冲洗一定时间后，吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h；

（2）取沉淀液20~40ml，离心沉淀并以生理盐水洗2次，吸上清；

（3）加10ml PBS液，混匀，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（4）过滤后1000rpm/min，10min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。返回搜狐，查看更多