表观遗传修饰是肿瘤发生、发展过程中的重要影响因素之一，DNA 甲基化（5mC）/ 羟甲基化（5hmC）、组蛋白修饰、非编码 RNA 调控等方式会对基因功能和表达水平进行调控，从而影响肿瘤的进展。DNA 5mC / 5hmC 作为表观遗传学修饰的重要机制，是表观遗传修饰领域的研究热点。5hmC 作为一种新兴且稳定的表观遗传标记，不仅是 DNA 去甲基化的中间产物，同时在多种生物学行为和个体生长发育环节发挥着重要的作用，受到众多研究者的追捧和青睐，并在肿瘤检测中逐渐被应用。那么，5hmC 究竟有哪些意义，对临床有着什么样的研究价值呢？今天，我们从 5hmC 的发现、提取、分析、检测和临床应用等方面给大家逐一介绍。

01   5hmC 的生成和分布特点

1953 年，研究者在 T2 噬菌体 DNA 中首次发现 5hmC，而后直到半世纪后，2009 年《科学》杂志中揭示了 5mC 通过双加氧酶（TETs）氧化生成 5hmC，且首次证明人脑中富含 5hmC，由此拉开了 5hmC 的研究序幕。5mC 通过 TETs 酶催化氧化形成 5hmC，5hmC 是 DNA 去甲基化的中间产物，也被称为 “第六碱基”。此外，TETs 酶还可以将 5hmC 进一步氧化生成 5-甲酰胞嘧啶（5fC）和 5-羧基胞嘧啶（5caC），上述产物都是去甲基化过程中的表观遗传修饰，同时也调控 DNA 去甲基化的进程。

图示：DNA 去甲基化修饰原理图

5hmC 广泛存在于人体内和动植物中，相比较于 5mC，不仅含量远远偏低（5hmC 在人体内仅是 5mC 的 0.1~0.01 倍），且分布上也呈现出组织特异性。5hmC 在脊髓和中枢神经中含量最高，在肾脏、心脏、肺部、骨骼肌、膀胱等部位含量居中，而在脾脏、肝脏中含量最低。在全基因组测序得到的图谱中，5hmC 主要集中在特定的基因区域，例如在启动子、外显子和基因体区域，而在基因间区则相对缺失。大量研究结果显示：5hmC 在血液肿瘤和实体肿瘤中总体呈现减少趋势，即在肿瘤组织内含量较正常组织显著降低。由泰莱生物合作在 Cell Research 杂志发表的研究证实，5hmC 水平随着肺癌的进展而呈现逐渐降低，进一步表明 5hmC 与肿瘤疾病密切相关。5hmC 作为一种 biomarker，在肿瘤筛查、诊断和监测等方面具有重大的临床应用价值。

02   5hmC 的检测手段

常用的检测甲基化胞嘧啶的技术，如传统重亚硫酸氢盐测序和甲基敏感限制性内切酶的方法，均不能有效区分 5mC 和 5hmC，显著阻碍着关于 5hmC 研究的深入开展。随着技术的创新和发展，开发了 nano-hmC-Seal、TAB-Seq、OxBS-Seq 和 hMe-Seal 等新型技术，能够对 5hmC 高效地测序分析。其中，由泰莱生物合作开发的灵敏的基于化学标记的低输入全基因组 5hmC 测序方法（hMe-Seal），运用了先进的点击化学技术，通过生物素选择性标记并捕获 cfDNA 5hmC，然后对 5hmC 片段进行扩增，能够高效地对 cfDNA 5hmC 进行测序分析，cfDNA 5hmC 富集的基因可以鉴别出更丰富的生物过程，更有利于保留具有诊断价值的 cfDNA 特征信息。

图示：hMe-Seal 测序原理示意图

03   5hmC 的临床意义和价值

5hmC 具有组织分布的特异性，在疾病状态下修饰稳定，因此对于在肿瘤早筛、精准诊断、肿瘤分化程度、预后预测等领域具有广阔的临床应用前景，也被作为多种肿瘤疾病早期诊断和预后的新标志之一。研究团队在肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和血液肿瘤等多种肿瘤样本中均发现了 5hmC 总体水平的下降，水平和分布的特征性信息能有效地辅助肿瘤的诊断和监测，5hmC 已逐渐成为一种重要的新型肿瘤生物标志物。

泰莱生物利用其开发的 hMe-Seal 微量全基因组测序方法技术，先后在国际期刊 Cell Research、Clinical Epigenetics 上发表了多项关于 cfDNA 5hmC 的研究成果，分别表明了 cfDNA 5hmC 在多种不同癌种中的辅助诊断作用和临床价值。

图示：cfDNA 5hmC 水平随着肺癌的进展而降低，表明 5hmC 可以作为诊断肺癌的潜在标志物（图片来源：Cell Res. 2017;27(10):1231-1242. doi:10.1038/cr.2017.106）

随着生命科学的发展，相关研究的逐渐深入和测序分析技术的开展将 5hmC 表观遗传作用提升到一个更加精确的维度。同时，当前研究表明 5hmC 在包括肿瘤等多种疾病组织内的表达发生了特异性改变，为肿瘤疾病的早发现、早诊断及治疗也提供了新的方向，具有重要的临床运用价值。不仅如此，5hmC 在肿瘤术后复发监测、预后判断以及肿瘤溯源等领域的研究前景同样巨大，作为早筛诊断、临床诊疗的辅助工具有着巨大潜力。值得注意的是，在单癌种的早期辅助诊断领域，已有基于相应技术转化落地的产品公诸于世。

以肺癌为例，从临床角度看，绝大多数肺癌的早期临床表现为肺结节，因此，早期发现并识别恶性肺结节患者是降低肺癌死亡风险的重要预防措施。泰莱生物基于独家多组学技术成果，将 cfDNA 羟甲基化、血液中代谢物质、胸部 CT 等项目纳入基于多组学的肺结节良恶性鉴别诊断产品，构建出了多组学的融合模型。

去年 4 月，同济大学附属上海市肺科医院牵头发起了 MISSION 计划（全称：Multi-omIcs claSSIfier for pulmOnary Nodules，即基于多组学的肺结节良恶性鉴别诊断前瞻性多中心临床研究），旨在利用基于影像组学、表观基因组学、代谢组学、临床表型组学等多组学技术，针对医学影像显示肺结节的患者进行肺结节良恶性鉴别诊断，以推进早期肺癌的诊断效率并帮助肺癌患者更早实施临床诊疗，从而提升患者生存率。中国科学院大学宁波华美医院、南昌大学第一附属医院、兰州大学第一医院、遵义医学院附属医院、山东省公共卫生临床中心（原山东省胸科医院）、安徽医科大学附属第一医院等联合参与组成 MISSION 协作组。至今，MISSION协作组、武汉大学-泰莱生物生命健康大数据研究中心、泰莱生物三方共同协作，进行了该计划第一阶段的研究。

MISSION 计划拥有目前我国该领域内最大（获得病理诊断结果）规模的临床研究队列，经过分析万例临床肺结节患者胸部 CT、血液中代谢物质及 cfDNA 羟甲基化水平数据，构建出了肺结节诊断多组学融合模型，并以此转化了斐盼安®（影像组学 + 代谢组学）、斐盼康®（影像组学 + 代谢组学 + 表观基因组学）两款产品，可对肺结节良恶性鉴别提供高效、可靠的参照，针对早期肺癌临床诊疗，包括肺癌早筛、早诊、性质判定、手术决策、预后评估等任务的优化与完善可起到相当的作用。

多组学是全新的生物学分析方法，也是医学界最前沿的研究领域。基于基因组、表观组、蛋白组、代谢组、微生物组等多个不同生命环节、不同维度的大量分子水平生物数据，利用生物信息统计分析、计算生物以及机器学习等技术，以实现对生命过程、疾病等集合超多影响因子的复杂生命现象进行高层次的分析、解读，以此应用于肿瘤筛查、肿瘤辅助诊断及肿瘤术后、预后评价指标。

当前，学界和产业界针对 5hmC 的研究还在继续，相信未来将进一步明确与疾病有关联的 5hmC 位点，也会有更加前沿和新兴的检测产品，能够进一步提高包括早期肺癌在内的泛肿瘤检测的准确性和灵敏度，有助于实现更多癌种的早发现、早诊断、早治疗。

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