非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是慢性肝病的主要病因，非酒精性脂肪肝炎（NASH）是NAFLD进展中重要的环节，伴有肝细胞肿胀、肝脏坏死性炎症和肝纤维化，部分患者可进一步发展为肝硬化或肝细胞癌。肝活检仍是NASH诊断及分期的金标准，然而肝活检存在采样误差高，侵入性导致患者依从性差、并发症风险高。尽管其存在局限性和争议，入组参加NAFLD临床试验的患者均需接受肝活检。因此，迫切需要无创诊断生物标志物监测疾病进展及评估治疗反应。尽管已报道了多种无创生物标志物用于检测肝纤维化和NASH，但性能差异较大，需在单一研究队列中系统对比其性能。

阿姆斯特丹大学医学中心临床流行病学教授Patrick M Bossuyt领导的一项LITMUS研究，对比了17种无创生物标志物在识别NASH伴有显著或晚期纤维化的性能，发现对于NASH和临床显著纤维化，没有单一生物标志物和多标志物评分可达到预期准确性（AUC 0.80）；对于晚期纤维化，基于蛋白质组标志物评分的SomaSignal、基于PRO-C3的纤维化算法ADAPT和FibroScan肝硬度检测达到了可接受的准确性，AUC分别为0.90、0.85、0.83。相关研究发表于Lancet Gastroenterol Hepatol，题目为：Biomarkers for staging fibrosis and non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease (the LITMUS project): a comparative diagnostic accuracy study。该研究确定的生物标志物临界值，有望提高NASH药物临床试验入组效率。

该研究的价值

LITMUS为规模最大的诊断准确性对比研究之一，比较了17种无创单一生物标志物和多标志物评分的性能，以识别NASH和显著纤维化（即高危NASH；NAFLD活性评分≥4纤维化程度[F]≥2），以及晚期纤维化患者（F≥3），以肝活检为参考标准。

基于生物标志物评估，有望用于药物临床试验入组人群筛选。既往临床试验纳入标准基于肝活检。然而，筛选失败的比例（即接受了肝活检，但不符合纳入标准）较高，占筛查人数的四分之三以上，导致高成本、高风险。基于本研究确定的标志物临界值，如果仅对标记物检测阳性的个体进行肝活检，则可以将筛查失败率降低至三分之一以下。

准确的无创诊断检测意义重大：有助于识别进展风险较高和临床结局不佳的NASH患者，提供预防干预窗口，亦可监测药物治疗效果。

共入组966例肝活检和配对血清NAFLD患者

该研究的样本来自欧洲13个国家，招募时间2010年1月6日至2017年12月29日，患者均经过肝活检确诊。生物标志物的诊断准确性表示为以肝脏组织学为参考标准的受试者工作特征曲线下面积（AUC），并与同一亚组中纤维化-4指数（FIB-4）比较。共登记1430例NAFLD患者，最终纳入966人（403女性和563男性）。966例入组者中，335人（35%）经肝活检证实为NASH伴显著纤维化，271人（28%）为晚期纤维化。

生物标志物检测

单一生物标记物：5种生物标志物经LITMUS项目中央实验室检测，分别是CK-18 M30、CK-18 M65、PRO-C3、PRO-C 4和PRO-C6，均基于ELISA法。

肝活检后6个月内，应用振动控制瞬时弹性成像(VCTE)检测肝脏硬度(LSM) 和受控衰减参数（CAP）。

多标记物评分：7种标志物属于多标记物评分，分别是MACK-3（HOMA-IR、AST和CK-18 M30）；Cao 2013（ALT、血小板计数、CK-18 M30和甘油三酯）；ADAPT（年龄、血小板计数、糖尿病和PRO-C3）；FIBC3（年龄、BMI、糖尿病、血小板计数和PRO-C3）；ABC3D（年龄、BMI、糖尿病、血小板计数和PRO-C3）；NAFLD纤维化评分（NFS；年龄、BMI、空腹血糖受损或糖尿病、AST与ALT的比值、血小板计数和白蛋白）和APRI（AST与血小板计数之比）。

增强型肝纤维化(ELF)评分由三种肝纤维化标志物组成，包括透明质酸、基质金属蛋白酶-1和III型胶原氨基端前肽的增强型肝纤维化（ELF），用ADVIA Centaur CP平台检测。

SomaSignal评分所需数据在英国SomaLogic实验室检测。SomasSignal NASH基于回归模型，包括12种脂肪变性相关蛋白、14种小叶炎症相关蛋白、5种肝细胞气球样变相关蛋白和8种肝纤维化相关蛋白。通过模型评估脂肪变性（NAFLD活性评分[NAS]0 vs 1-3）、肝细胞气球样变（0 vs 1-2）、小叶炎症（0–1 vs 2-3）和纤维化（0–2 vs 2-4期）严重程度。将脂肪变性、炎症和气球样变模型得分相乘，作为NASH的SomaSignal标记。

性能对比 蛋白标志物组合SomasSignal灵敏度最高

性能最好的无创诊断标记物是SomaSignal、ADAPT和MACK-3。100例接受SomasSignal检测的NAFLD患者，35人结果阳性；100例接受ADAPT检测的患者，24人结果阳性；100例接受MACK-3检测的患者，21人结果阳性。经肝活检确认，24例SomaSignal检测呈阳性的患者、16例ADAPT检测呈阳性的患者、14例MACK-3检测呈阳性的患者为真阳性，肝活检确认属于NASH伴临床显著纤维化。SomasSignal灵敏度最高。

对于评估晚期纤维化，单一生物标志物中，只有LSM-VCTE准确性达到了0.80，AUC为0.83（0.80–0.86）。五种多标记物评分准确性超过了0.80，但只有SomasSignal和ADAPT两种具有统计学意义。

如果只有标志物阳性的患者进行进一步肝活检，17种标志物有11种可以将临床试验肝活检筛查失败率降低到33%。对NASH和临床显著纤维化，性能最佳的是SomaSignal，4例阳性中1例经肝活检为真阳性，其次是ADAPT（6例阳性中1例经肝活检为真阳性）、MACK-3（7例阳性中1例经肝活检为真阳性）和PRO-C3（九例中有1例经肝活检为真阳性）。

在检测NASH和临床显著纤维化时，没有单一标志物或多标志物评分的准确度可以替代肝活检。然而，在临床试验患者招募中，可用于患者初筛。

目前，临床试验的招募是基于肝脏活检。限制了对NASH和显著纤维化患者的筛查。一种成功的筛查生物标志物有望识别大多数NASH伴显著的纤维化患者，同时大大减少需要肝活检的人数。

无筛选生物标志物的情况下， 966名入组患者均需接受肝活检，最终335名NASH合并显著纤维化。因此，肝活检的筛选效率为966例患者中的筛选到了335例（35%）。本研究发现，准确性最高的SomaSignal，可将肝活检患者数量减少65%，从966人减少至338人，最终筛选到232例NASH合并显著纤维化的患者（筛选效率69%）。本研究其它多种生物标志物同样可提高筛选效率，但与SomaSignal相比，灵敏度较低。

总之，该研究作为规模最大的诊断准确性对比研究之一，比较了17种不同的无创诊断生物标志物的性能。结果表明，在检测NASH合并显著纤维化方面，无单一生物标志物可取代肝活检。然而一些多标志物评分，如SomaSignal和ADAPT，可用于识别晚期纤维化。尚无诊断NASH和肝纤维化的生物标志物获批，进一步突显了LITMUS联盟在验证和推动获监管部门批准的诊断NAFLD和NASH生物标志物的迫切性。LITMUS项目将继续收集前瞻性LITMUS研究队列数据，并分析血液和影像生物标志物，推动临床试验中新的和现有干预措施的评估，并改善NAFLD患者临床诊疗。

参考资料

Vali Y, Lee J, Boursier J, et al. Biomarkers for staging fibrosis and non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease (the LITMUS project): a comparative diagnostic accuracy study. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2023 Mar 20:S2468-1253(23)00017-1. doi: 10.1016/S2468-1253(23)00017-1. Epub ahead of print. PMID: 36958367.