在细胞成像应用中，理想的荧光探针应具备高量子产率、高信噪比、高特异性等特点[19-20]。为了满足这些要求以实现较好的成像效果，如何精确设计和制备高性能荧光AuNCs探针至为关键。虽然在文献中已有大量报道将AuNCs作为新兴成像探针应用于荧光成像，然而其进一步的应用拓展仍受到荧光波长短、荧光量子产率低及亚细胞器靶向性差等因素的限制。为了解决这些问题，研究者们提出了多种有效的AuNCs功能化设计与制备策略，并取得了较为显著的进展。

当AuNCs的荧光量子产率显著高于细胞自荧光物质时，AuNCs成像的信噪比将得到明显的提高，进而增强其细胞内荧光成像性能。为了有效地提高AuNCs的荧光量子产率，需要对该类材料的发光机理及其构效关系有一个清晰的认识。基于AuNCs精确的分子结构，研究者通过系统调控AuNCs的原子组成和配体性质等，深入研究了多种因素对于AuNCs荧光的影响，初步阐明了AuNCs的发光机理[21-22]。目前，关于AuNCs的发光机理的解释中被广泛认可的观点是，AuNCs的荧光来源于小尺寸Au核引起的离散电子能级，以及Au核-表面配体的电子传导等的综合效应。通过调控Au核的电子能级、增强Au核与配体之间的电子传导或者限制表面配体的自由度，以及利用AuNCs的聚集诱导发光性质等途径可以有效地提高AuNCs的荧光量子产率。因此，根据目前对AuNCs光致发光机理的理解，研究者们提出了多种可有效提高AuNCs荧光量子产率的设计与制备策略，如图2所示。

当前，普遍采用的提升AuNCs的荧光量子产率的方式主要可以分为合金掺杂、表面配体调控、自组装以及聚集诱导发光等。在合金掺杂策略中最常用的合金元素为银，这主要是由于Au与Ag性质相近（同属IB族元素）且晶格适配。2014年，汪恕欣等人使用Ag掺杂策略将AuNCs的荧光量子产率提高到原先的200倍（图2 （a））[23]。除了Ag掺杂之外，姚传好等人采用Cd掺杂策略改变了金核的表面原子结构，从而显著提升了AuNCs的荧光量子产率[24]。由于AuNCs的性质与金核及表面配体密切相关，除了对AuNCs的金核进行调控外，AuNCs荧光量子产率的提升也可以通过配体改性实现。Chen Zhan课题组以谷胱甘肽（GSH）和组氨酸为共配体，得到了比单独组氨酸为配体所合成AuNCs荧光量子产率更高的产物[25]。除此之外，通过限制AuNCs表面配体的自由度也可以显著提升AuNCs的荧光量子产率。例如，陈伟课题组以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶（ATT）作为配体合成AuNCs，通过加入精氨酸与配体之间形成氢键，实现对配体灵活度的限制和簇内电子传导的增强，从而制备得到了超高荧光量子产率（65%）的绿色荧光AuNCs （图2（b））[26]，并在后续工作中基于相同原理以双席夫碱类分子增强AuNCs荧光，得到了量子产率为48%的红色荧光AuNCs[27]。

谢建平课题组于2012年报道了AuNCs的溶剂致聚集诱导发光现象，成功制备了荧光量子产率为15%的AuNCs聚集体（图2 (c)）[28]。然而，在细胞成像的过程中，溶剂致聚集诱导发光现象在细胞环境、溶剂稀释等因素的影响下易失效，因此需要稳定的AuNCs聚集体制备方法。目前广泛采用的制备聚集体的方法为自组装策略，即将AuNCs组装为纳米片、纳米凝胶以及合成纳米颗粒等不同形貌。在各种组装策略中，基于各组分的正负电荷之间的静电作用所构建的AuNCs自组装体是较常采用的方法。例如，2016年，Xavier Le Guével课题组和谢建平课题组分别报道了以正电聚合物聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）与壳聚糖诱导AuNCs自组装，结果表明得到的自组装纳米颗粒均具有更高的荧光量子产率（图2 (d)）[29-30]。除此之外，基于主客体相互作用的超分子自组装也可以用于提高AuNCs的荧光量子产率[31-32]。

图  2  提升AuNCs量子产率的方式：（a）合金掺杂改性Au核[23]；（b）表面配体工程[26]；（c）、（d） 聚集诱导发光与AuNCs自组装[28-29]

Figure 2.  Methods to improve the quantum yield of AuNCs: (a) Alloy doping in Au core[23]; (b) Surface ligand engineering[26]; (c), (d) Aggregation-induced emission and AuNCs-based self-assemblies[28-29]

增强AuNCs荧光成像过程中的信噪比的另一种方法是提高细胞对AuNCs的摄取效率。为了实现高的细胞摄取效率，阐明AuNCs的细胞内化机制具有较为重要的意义。2014年，Nienhaus课题组通过荧光成像详细研究了HeLa细胞对AuNCs的内化过程（图3（a））[33]，发现在该过程中具有超小尺寸的AuNCs会先富集在细胞膜表面，进而主要通过网格蛋白介导的内吞机制和大胞饮作用进入细胞。作者还进一步通过荧光寿命成像技术原位监控了AuNCs的胞内稳定性[34]，为设计开发高稳定、高成像性能的AuNCs提供了重要的基础。

除此之外，提高AuNCs的细胞摄取率还可以通过自组装[35]、细胞靶向配体修饰[36]以及表面正电荷修饰等方法[37]。由于细胞膜的表面呈负电位，因此，相比表面带负电的AuNCs，表面正电荷修饰的AuNCs更易于与细胞膜结合，从而提高AuNCs的细胞摄取率。然而，自组装与表面正电荷修饰虽然可以提高大部分细胞对于AuNCs的摄取率，但是无法区分不同的细胞类别，对于基于荧光成像的精准诊疗应用缺乏指导意义。由于部分癌细胞表面具有比正常细胞更高的叶酸、糖受体的表达水平，因此通过修饰叶酸、糖类等特定生物分子不仅可以提高AuNCs在叶酸、糖类等受体过表达的癌细胞的摄取率，增强其荧光成像性能，也可以实现对此类癌细胞的特异性区分（图3(b)）[38-39]。如图3 (c)所示，叶酸修饰的AuNCs在叶酸受体过表达的HeLa、KB细胞的摄取量明显高于未过表达的MG63、A549等细胞。

图  3  （a）荧光成像技术研究AuNCs进入细胞的过程[33]；（b）在AuNCs表面修饰叶酸的示意图[38] ；（c）通过流式细胞术研究未修饰AuNCs （SG）与叶酸修饰AuNCs （FA）在具有不同叶酸受体表达水平的细胞的摄取量差异[38]

Figure 3.  (a) Investigating the endocytosis of AuNCs by fluorescence imaging[33]; (b) Scheme of modification of folic acid on the surface of AuNCs[38]; (c) Differences in cellular uptake of unmodified AuNCs (SG) and folic acid-modified AuNCs (FA) in cells with different receptor expression levels by flow cytometry[38]

随着AuNCs在细胞荧光成像方面的应用的逐步扩展，如何在亚细胞水平上控制AuNCs在细胞内的定位，进而实现精准的细胞器成像成为了研究者们普遍关注的问题。

借鉴其他荧光探针的靶向细胞器策略，多种特异性靶向细胞器的分子（如三苯基膦等）被用于修饰Au-NCs表面以获得靶向细胞器的能力。例如，庞代文课题组通过特异性靶向细胞核的TAT多肽修饰AuNCs，从而赋予AuNCs靶向细胞核的能力[40]。朱满洲课题组在合成中加入带巯基的三苯基膦配体，将原先靶向溶酶体的AuNCs改造为可特异性靶向线粒体的AuNCs[41]。Yangang Wang课题组将靶向内质网的磺酰脲化合物修饰于AuNCs表面后，表现出较为明显的靶向内质网的能力[42]。这些具备特异性靶向性能的AuNCs为研究人员提供了进一步胞内精准成像的重要前提，借助于AuNCs的低毒性、优异的光稳定性等特点，使得长时间动态追踪特定细胞器的生物行为成为了可能。2021年，Yuan Wang等报道了一种可靶向线粒体的荧光AuNCs，且其荧光寿命与温度密切相关，从而利用荧光寿命技术揭示了细胞内不同区域线粒体的温度存在明显差异（图4）[43]。

图  4  AuNCs作为荧光探针实现细胞内 (a)线粒体成像以及(b)使用荧光寿命成像技术研究细胞内不同区域线粒体温度分布[43]

Figure 4.  AuNCs as fluorescence probes for (a) cellular imaging of mitochondria and (b) investigating temperature of mitochondria in different regions within a cell through fluorescence lifetime imaging[43]