来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱刘建民

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，会导致认知能力逐步下降，其特征包括β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）在大脑中的沉积和脑组织葡萄糖代谢受损[1]。探索该病的发病机制和治疗方法一直是研究的热点。研究显示AD早期就可以观察到脑组织中有氧糖酵解的改变[2]。抑制糖酵解相关主要酶后，人类胎儿星形胶质细胞的胞内胞外Aβ沉积增加，且这些细胞更容易受到Aβ的毒性影响[3]。而增加有氧糖酵解可以改善Aβ诱导的星形胶质细胞活化，并改善AD小鼠的空间认知障碍[4]。因此，靶向神经胶质细胞的糖酵解可能是AD的一种有前景的治疗方法。

骨钙素（osteocalcin，OCN）是一种由成骨细胞特异性分泌的多肽，可通过其代谢活性形式——非羧化骨钙素（ucOCN）发挥多种内分泌功能，同时其在中枢神经系统中的作用正在被研究。OCN可以改善帕金森病小鼠的运动缺陷和多巴胺能神经元丢失[5]。给予老年小鼠外源性OCN或含OCN的年轻小鼠血浆可以改善老年小鼠的认知功能，进一步研究发现G蛋白偶联受体158（Gpr158）是OCN作用于中枢神经系统的受体，用以对抗年龄相关的海马依赖性认知障碍[6]。上述证据表明，OCN对认知能力下降有保护作用。然而，OCN是否能在AD状态下提高认知能力不得而知。

近日，上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌科、上海市内分泌代谢病研究所和上海交通大学BIO-X研究院单畅博士、张登硕士、马冬霓博士，以及杨毓莹博士、李胜天教授和刘建民教授等合作在Cell Death Discovery上发表了题为“Osteocalcin ameliorates cognitive dysfunctions in a mouse model of Alzheimer’s Disease by reducing amyloid β burden and upregulating glycolysis in neuroglia”的研究。该研究发现OCN可以减少脑组织中Aβ沉积，上调神经胶质细胞的糖酵解，从而改善阿尔茨海默病小鼠的认知功能障碍，提示OCN可能作为治疗AD的潜在因子，并为能量调节治疗阿尔茨海默病提供了更多可行性。

研究者通过给APP/PS1转基因AD小鼠每天腹腔注射1μg/kg或10μg/kg OCN 4周后进行行为学实验，分析发现OCN可以改善AD小鼠的焦虑样行为和认知功能障碍。在开放场实验（open field test，OFT）中，AD小鼠进入开放场中心区域的次数和在中心区域的时间较WT小鼠均有减少的趋势，而OCN增加了AD小鼠进入中心区域的次数及在其中的时间（图1A）。在高架十字迷宫实验（elevated plus maze test，EPMT）中，AD小鼠较WT小鼠进入开放臂的次数和处于其中的时间均减少，而OCN显著增加了AD小鼠进入开放臂的次数及相应的时间（图1B）。在明暗穿梭实验（light-dark transition test，LDTT）中，与WT小鼠比较，AD小鼠在明室中的时间显著减少，而OCN可以增加AD小鼠在明室中的时间（图1C）。在Morris水迷宫实验中（Morris water maze test，MWMT），AD小鼠在训练阶段较WT小鼠表现出潜伏期显著增加，而OCN治疗降低了AD小鼠的逃避潜伏期（图1D）。

同时，研究者通过对各组小鼠脑组织切片后进行免疫组化实验后，发现OCN显著降低了AD小鼠海马和皮质中的Aβ沉积。在AD小鼠的海马和皮质中可以观察到明显的淀粉样斑块（图2C），但在WT小鼠中没有观察到（图2A-B）。1μg/kg和10μg/kgOCN可以显著降低AD小鼠海马和皮质中淀粉样斑块的沉积（图2D-E）。

局部场电位（local field potential，LFP）可用于表示神经元网络中的总突触活动，常在哺乳动物中表现出电压振荡。特定的振荡频率与行为功能和神经连接有关[7]。为了研究OCN是否在AD小鼠内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）的突触活动中起作用，研究者在腹腔注射1μg/kg或10μg/kg OCN后观察mPFC的LFP功率变化。在0–200 Hz波段时，1μg/kg OCN改变了AD小鼠的LFP功率，而在WT小鼠中则是10μg/kg OCN改变了WT小鼠的LFP功率（图3A）。并且，1μg/kg OCN显著增加了WT和AD小鼠在High Gamma波段的LFP功率（图3B），但在Ripple波段没有改变（图3C）。而10μg/kg OCN显著增加了Ripple波段的LFP功率（图3E），但在High Gamma波段没有改变（图3D）。

进一步研究发现，OCN抑制了AD小鼠海马中星形胶质细胞的增殖。越来越多的证据表明，神经胶质细胞（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）的激活不仅在神经炎症中起重要作用，而且也是神经退行性变过程中介导Aβ生成、神经元丢失和脑葡萄糖代谢失调的关键因素[8-10]。因此，研究者对小鼠海马中的GFAP和Iba1阳性细胞进行染色，发现AD小鼠中星形胶质细胞显著增殖，而腹腔注射1μg/kg OCN后可显著抑制AD小鼠中的这种现象（图4A，C）。对于小胶质细胞，AD小鼠的海马中Iba1阳性小胶质细胞数量上调，1μg/kg OCN降低了AD小鼠中Iba1阳性的小胶质细胞数量但具有临界效应（图4B，D）。qPCR（图4E-F）中也可以观察到关于GFAP和Iba1表达的类似结果。

为了进一步探究神经胶质细胞在AD疾病中的作用及其相关机制，研究者进行了一系列体外实验，发现OCN增强了星形胶质细胞的糖酵解能力。Aβ激活星形胶质细胞并损害其能量代谢，主要特征是糖酵解减少[11]。而OCN显著增加了C8-D1A细胞（一种星形胶质细胞系）的葡萄糖消耗（图5A）。此外，OCN处理的C8-D1A细胞培养基中，其乳酸浓度（代表培养细胞的糖酵解活性）升高（图5B），当给药100ng/ml OCN时达到最大乳酸浓度。在此浓度下，研究者使用seahorse实时能量代谢分析仪，发现OCN促进了C8-D1A细胞的最大糖酵解能力（图5C）。同时，细胞的氧化磷酸化水平未受OCN影响（图5D）。Pdk1是增加糖酵解通量的关键酶，Ldha是乳酸生成的关键酶[12,13]。OCN在mRNA和蛋白水平上调Pdk1的表达，同时上调Ldha蛋白水平（图5E-G）。

Gpr158是OCN调节认知功能的作用受体[6]。基于研究者发现Gpr158在星形胶质细胞中的表达，为了研究OCN对胶质细胞的具体作用机制，研究者通过慢病毒shRNA干扰Gpr158在C8-D1A细胞中的表达来探究OCN是否通过Gpr158来改善糖酵解。在Gpr158蛋白下调56%（图6A，B）的情况下，OCN对葡萄糖消耗和乳酸产生增加的影响被消除（图6C，D）。此外，在Gpr158敲除细胞中，Pdk1的表达下调，并且Pdk1和Ldha的mRNA和蛋白水平在OCN处理情况下没有变化（图6E–G）。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现OCN可以改善AD小鼠模型中的焦虑样行为和认知功能障碍，同时减轻Aβ沉积，并抑制海马中星形胶质细胞的增殖。此外，OCN改变了AD小鼠内侧前额叶皮层中局部场电位的功率，尤其是增加了高γ波段的LFP功率。体外研究表明，OCN增加了星形胶质细胞和小胶质细胞的有氧糖酵解。敲减星形胶质细胞上Gpr158受体后OCN对胶质细胞糖酵解的影响被消除。该工作为OCN在AD中的神经保护作用提供了机制性见解，为理解骨骼和中枢神经系统之间的交互作用提供了更多证据，为能量调节治疗阿尔茨海默病提供了更多可行性。值得注意的是，本研究并未探讨AD小鼠认知相关脑区中有氧糖酵解是否下调，以及OCN能否改变这一现象及是否通过与受体Gpr158结合在AD中发挥有益作用，这些均有待进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41420-023-01343-y

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参考文献

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本文完