SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

发酵工艺学实验报告

糖化酶发酵、提取及活力测定实验

学院：生命科学学院

专业班级：生物工程1602

项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻

指导教师：王丽娟

2018年6月

糖化酶发酵、提取及活力测定实验

何健雨王丽娟

生命科学学院生工1602班

1. 实验目的

(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；

(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。

(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法

2. 实验原理

葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。

生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。

糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。

酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。

3. 实验材料

优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；

0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。

4. 方法步骤

待测酶液的制备:

称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓

冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶

中。沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次,最后

全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力

在100-250U/mL范围内),摇摇匀。通过4层纱布过滤滤,滤液供测定用。

4. 实验结果

发酵液

110 干酶泥0.03

上清

发酵液上清干酶泥

A 5.3 6.9

B 3.7 6.0

酶活92.84 52.1

5.结论与讨论

结论：干酶泥所需剂量普遍高于发酵液上清，干酶泥酶活更高。

讨论：实验过程中PH调节无法做到精准，可能会造成误差。

实验总结（含实验体会、关键步骤、注意事项等）

实验体会：通过本次实验，了解了糖化酶发酵、提取及活力测定的方法；关键步骤：鲜酶泥一定要完全转移，不可有浪费，否则会导致测量不准注意事项：将鲜酶泥转移到称量纸上进行干燥,勿用滤纸,滤纸会吸附

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ 发酵工艺学实验报告 糖化酶发酵、提取及活力测定实验 学院：生命科学学院 专业班级：生物工程1602 项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻 指导教师：王丽娟 2018年6月

糖化酶发酵、提取及活力测定实验 何健雨王丽娟 生命科学学院生工1602班 1. 实验目的 (1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺； (2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。 (3)学习并掌握糖化酶活力测定方法 2. 实验原理 葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。 生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。 糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。 酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。 3. 实验材料 优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）； 0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。 4. 方法步骤

糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺 姓名：吴启华 12生物工程1班学号：1214200027 指导老师：柯德森、姚焱；同组者：严少杰，李海毅；时间:2015/11/30---2015/12/14 摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与糖化酶的浓度的关系。 本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；加入20g离子交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.58%，加入25g离子交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。 关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力 1、前言： 糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物---糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将α-1，4-键和α-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为 构型，几乎100%转变为葡萄糖。工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。 本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。 2、材料与方法： 2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6

糖化酶活力测定 1. 定义 1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。 2. 原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。 3. 试剂和溶液 (1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。 称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。配好后用 pH 计校正。 (2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。 (3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。 (4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。 (5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。 (6硫酸溶液(2mol/L。 (7 20g/L可溶性淀粉溶液。 (8 10g/L淀粉指示液。 4. 仪器和设备

恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。 5. 步骤 (1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先 用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。沉 渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。 (2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅 速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。取出,加硫酸溶液 2ml ,立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定,直至蓝色刚好消失为其终点。 (3计算 X =(A -B c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×(A -B c×n 式中 X ——样品的酶活力(u/g或 u/ml A ——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml B ——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml c ——硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L 90.05——与 1ml 硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L相当的以克表示的葡萄糖的质 量

货号: QS2625 规格：50管/24样糖化酶(Glucoamylase) 试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。 测定原理： 糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在540nm 处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化酶的活力。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。 酶液提取： 1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提 取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细 胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 3.培养液或其它液体：直接检测。 酶活性计算公式： 标准曲线：y = 0.2164x - 0.0182，R2 = 0.9992 1. 按照蛋白含量计算 第1页，共2页

华南农业大学 综合实验报告 实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验 计划学时：6 所属课程名称：食品与发酵工业分析 班级：09生物工程2班 姓名：叶思婕 学号：200930620124 实验课指导老师：沈玉栋

摘要 测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。 关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法

1 前言 酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。目前已有几十种酶成功地用于食品工业。例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。 酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料。淀粉酶的种类很多，根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。液化型淀粉酶(又称α-1,4糊精酶，俗称α-淀粉酶)能水解淀粉中α-1,4葡萄糖苷键，水解淀粉为分子量不一的糊精，淀粉迅速被液化。使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消，以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由

我国糖化酶的研究概况 糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。主要的内容包括：一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。 糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。 三、糖化酶的特性 1、糖化酶的热稳定性 在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生

酒曲糖化酶活力测定的实验方案 一、实验原理 固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高，淀粉利用率就高。可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。 二、仪器试剂 ⒈仪器:烧杯，量筒，容量瓶，250ml 锥形瓶，碱式滴定管，试剂瓶， 移液管 ⒉试剂：（1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的 可溶性淀粉2g （准确至0.001g ），于50mL 烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL 沸水的烧杯中，并用20mL 水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL ，当天配置使用。 （2）1g/L 葡萄糖标准溶液：准确称取预先在100~105℃烘干的无水葡萄糖1g(准确至0.0001g)溶解于水，加5mL 浓盐酸，用水定容至1L 。 （3）斐林试剂 A.甲液：称取15g 硫酸铜（O H CuSO 245 ）0.05g 亚甲基蓝，溶于水并稀释 至 1L 。 B.乙液：称取酒石酸钾钠，54gNaOH ，4g 亚铁氯化钾溶于水并稀释至1L 。 （4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6） a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL 冰乙酸，用水稀释至1000mL 。 B.2mol/L 乙酸钠溶液：称取272g 乙酸钠（CH3COOH ·3H2O ），溶于水并稀释至1000mL 。 将a ，b 等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 （5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L 。 （6）1 mol/L NaOH 溶液。 三.测定步骤 （1）5%干曲浸出液制备 称取相当于5g 的干曲的曲粉（准确至0.01g ）［曲粉量（g ）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL 烧杯中，加水（90－5×水分%）mL ，缓冲液10mL ，

第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 2010 92 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03 黑曲霉生产糖化酶及酶活测定 单 海 艳 （牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000） 摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。 关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言 （一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位 黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。 2．黑曲霉形态、生理、生态特性 孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。 3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。 （二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位 糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。 2．糖化酶的性质 糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％。 （1）糖化酶中糖和蛋白组成 糖化酶是一种糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊意义。 （2）糖化酶组分多型性 真菌产生的糖化酶组分多型性是常见的，市售的糖化酶中可分离出葡萄糖酶?和葡萄糖酶И两种组分。而市售黑曲霉生产的糖化酶曾分离出六种活性组分，每种均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖。这六种组分的分子量，沉淀系数，化学组分，等电点，酶的动力学及其它性质各异。培养基成分和的生产条件对糖化酶组分多型性也有影响，天然糖化酶在微生物培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而成多型性的酶类。 （3）糖化酶的热稳性 工业用的糖化酶都是利用它的热稳性，α-环状糊精可提高糖化酶的热稳性，最适温度范围一般为50℃～60℃。 （4）从酶PH 稳定性上看： 糖化酶具较宽的PH 值适应范围，但最适PH 为4-5。 （5）Ca 离子与酶结合后可使结构变得松散些，更有利于催化反应。 （6）糖化酶与底物亲和性 收稿日期：2009-11-26 作者简介：单海艳（1977—），女，牡丹江大学化工系讲师，研究方向：生物教学。 DOI:10.15907/j.cnki.23-1450.2010.07.036

淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 萌发的小麦种子（芽长约1cm） 2．仪器

（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL×1, 100mL ×1 （6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13 （8）试管架（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 （10）分光光度计 3．试剂（均为分析纯） （1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 （2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO 2 进入。若溶液混浊可过滤后使用。 （3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C 6H 8 O 7 ·H 2 O 21.01g，用蒸馏水溶解并定 容至1L。 B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na 3C 6 H 5 O 7 ·2H 2 O 29.41g，用蒸馏水溶解 并定容至1L。 取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 （4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤 1．麦芽糖标准曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力 一、原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α -1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 反应过程如下： 二、仪器、试剂 1、仪器 1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19； 2)烧杯：100mL×4； 3)三角瓶：100mL×1； 4)容量瓶：100mL×3，50mL×3； 5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1； 6)沸水浴； 7)冰浴； 8)扭力天平； 9)UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂

1) 1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。 2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂 将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。 三、操作步骤 1、葡萄糖标准曲线的绘制 取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm ，用0号管调零点，测出1~6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（mg ）为横坐标，做出标准曲线。 2、糖化酶活性测定 1) 将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至20~40单位/毫升，制成酶制备液； 管号 1mg/mL 葡萄 糖标准液（mL ） 蒸馏水 （mL ） DNS （mL ） 葡萄糖含量 （mg ） 光密度值 （OD 540nm ） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2

糖化酶的生产流程设计方案 糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - α- 葡聚糖葡聚糖水解酶, EC. 3. 2. 1. 3) ,是淀粉糖化工艺的主要酶类,被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业。目前,糖化酶的生产菌种主要为 黑曲霉。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同,工业 生产中,糖化酶的发酵生产水平在35 000～55 000UPmL 不等。糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪90 年 代初,液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵 工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升 了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同 存在不足之处,其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一 个较突出的问题,如实验室的种子制备需要15d 以上,发酵周 期通常200h 以上。 生产流程图 一、试验菌种的分纯

1、培养基 （1）固体培养基，察氏培养基+1％酵母膏+1％蛋白胨；（2）初筛培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=7:3:2:0.16 （3）诱变后培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=8：3:1.5:2:0.16，水80ml。 （2）原料：玉米粉、麸皮等 （3）菌种分纯 将麸皮采集菌种取出一部分，置入装有10mL生理盐水和若干玻璃珠的小三角瓶内，振荡15分钟，将上清液一次稀释成10-1、10-2、10-3，各取0.1mL做平板划线，29℃培养5~6天，分别挑取单个菌落接入斜面，29℃培养一周。 以大连某厂的生产用菌B-11为对照，对分离菌株做摇床发酵试验，96h后测定糖化力，配合镜检，确定诱变的出发菌株。 二、试验菌株的诱变 用生理盐水洗下成熟出发株的孢子、倒入5mL麦汁种1％酵母膏的三角瓶中，振荡1.5h，使孢子活化，后3500r/min.离心分离15分钟，用pH7.2磷酸缓冲液洗涤一次，再用缓冲液5ML洗转入小三角瓶内（内有数枚无菌玻璃珠），振荡10分钟，使孢子分散均匀，过滤，制成单孢子悬浮液，将浓度调至106个/ml 取10ml孢子悬浮液于9cm平板中，紫外线（UV）照射诱变2分钟（避光操作），紫外线动率15W，室温，搅拌，照射距离30cm。 向经紫外线处理的菌液中加入硫酸二乙酯（DES）稀液（原液

糖化酶活力的测定 一、实验目的 1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。 2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。 二、实验原理 糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。 碘量法定糖原理： 淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化： I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O NaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI 体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。 I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI 三、仪器、原料和试剂 仪器 吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。 原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。 试剂 1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。 2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。 3. pH 4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。取分析纯冰醋酸 5.78毫升定容至1000毫升。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。 4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。 5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。 6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。 四、操作步骤

固体曲糖化酶活力的测定 实验原理： 1.固体曲在酿造过程中将原料淀粉转化为可发酵糖类的 重要酶源。其中其主要作用的是糖化酶，它可将淀粉水 解为葡萄糖供微生物发酵，生成酒精及其它各种相应 的白酒成分。固体曲质量好，糖化活力高，原料淀粉利 用率高，出酒率也高。故糖化酶活力的高低是衡量固体 曲质量的重要指标。 2.固体曲糖化酶活力定义为：1g绝干固体曲，在30℃、PH=4.6 条件下，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。其测定 的方法可用修正的蓝-艾农法. 实验试剂： 1. 斐林试剂 2. 0.1%葡萄糖标准溶液（准确称取1g无水葡萄糖(预先烘干)， 用水溶解，加5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml 3. 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH= 4.6） 4. 0.01mol/L NaOH溶液称取4g NaOH ,用水溶解并稀释至1000ml 5. 2%可溶性淀粉溶液准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～ 105℃烘干），加少量水调匀，倾入80ml沸水中，继续煮沸至 透明，冷却后用水稀释至100ml. 实验步骤：

1. 5%固体曲沁出液的提取 称取5.6702g 固体曲（以绝干曲计）， 置于250ml 烧杯中，加入90ml 水和10ml,PH=4.6的缓冲溶液，摇匀，于30℃水浴中保温沁取1h ，每隔15min 搅拌一次，有脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲沁出液。 2. 固体曲糖化液的制备 吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，于30℃水浴中预热10min.准确加入5ml 5%固体曲沁出液，摇匀，立即计时。于30℃水浴中准确保温1h 。迅速加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。同时制作一空白液：准确吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，先加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，然后准确加入5ml 空白液，用水定容至刻度。 3. 测定 吸取斐林甲液、乙液各5ml ，置于锥形瓶中，准确加入 5ml 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%葡萄糖标准溶液（使后滴定时消耗0.1%葡萄糖标液在1ml 以内，且在1min 时间以内），摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，此次滴定操作需在1min 内完成。记录所消耗0.1%葡萄糖标准溶液的体积。 准确吸取5ml 糖化液代替5ml 空白液，其余操作同上。 计算公式： 糖化酶活力=c(V 0-V)×10001 5100 550???m 式中V0---5ml 空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，ml V---5ml 糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，ml

糖化酶的固定化试验 一、目的要求 本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。 二、基本原理 糖化酶是一种用途广泛的酶，粮食工业、食品工业、发酵工业都经常使用。随着生物技术的迅速发展,糖化酶的生产和使用水平也有了进一步的提高。 固定化技术是近年来迅速发展的一种崭新技术，固定化酶同游离酶相比有很多优点,它开辟了酶的许多新用途。游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。 酶的固定化方法：通常的固定化方法可以概括为四种：a、吸附法 b、共价偶联法 c、交联法 d、包埋法 4、包埋法 包埋法是借助于聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化目的的一种方法。反应条件温和，很少改变酶的结构，此方法对大多数酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的，其局限性是①、对底物和产物是大分子的采用此种方法固定化酶是不适用的②、高聚物网络或半透性膜对小分子物质扩散的阻力导致固定化酶的动力学行为偏离游离酶的动力学行为，活力减低。凝胶包埋是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法，把酶固定于聚合材料的格子结构中，这样可以防止酶蛋白游离释放，但底物仍能渗入格子内与酶接触，进行酶催化反应。 糖化酶活力的测定采用次碘酸钠法。糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1, 4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。次碘酸钠法的原理为在碱性介质（NaOH）中，碘歧化为次碘酸钠和碘化钠，次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为酸基。适当酸化，剩余的次碘酸钠与碘酸钠又生成碘，以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定。根据总碘量和硫代硫酸钠的用量，可对应获得甲醛的量。反应为： I2+2OH-=OI-+I-+H2O HCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2O OI-+I-+2H+= I2+H2O

淀粉酶活力测定 Prepared on 22 November 2020

淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 萌发的小麦种子（芽长约1cm） 2．仪器 （1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL× 1,100mL×1（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13（8）试管架（9）刻度吸管：2mL×3,1mL×2,10mL×1（10）分光光度计

实验四α-淀粉酶实验活力的测定方法 一、实验目的 了解并掌握淀粉酶的测定步骤，掌握其方法。 二、实验原理 液化型淀粉酶（α-淀粉酶）能催化水解淀粉，生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。本实验利用呈色反应来测定液化型淀粉酶水解淀粉作用的速度，从而测定淀粉酶活力的大小。 三、器材和试剂 1.器材 多孔白瓷斑、50ml三角瓶或大试管（25mm*200mm）、恒温水浴箱、烧杯、容量瓶、漏斗、吸管、纱布。 2.试剂 （1）原碘液称取I 2 11g、KI22g，加少量水完全溶解后，再定容至500ml，于棕色瓶中保存。 （2）稀碘液吸取原碘液2ml，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，于棕色瓶中保存。 （3）标准“终点色”溶液。 ①准确称取氯化钴40.2439g、重铬酸钾0.4878g,加水溶解并定容至500ml。 ②0.04%铬黑T溶液。准确称取铬黑T40mg，加水溶解定容至100ml。 取①液80ml与②液10ml混合，即为标准色。冰箱保存。 （4）2%可溶性淀粉称取烘干可溶性淀粉2.00g，先一少许蒸馏水混匀，倾入80ml沸水中。继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100ml。此溶液需要新鲜配制。 （5）0.02mol/L、pH6.0磷酸氢二钠溶液称取Na 2HPO 4 ·12H 2 O45.23g和C 6 H 8 O 7 ·H 2 O8.07g, 用蒸馏水溶解定溶至1000ml，配好后以酸度计或精密试纸校正pH。 （6）α-淀粉酶粉。 四、操作步骤 1.待测酶液的制备 （1）精密称取酶粉1-2g，放入小烧杯中。

（2）用少量的40℃0.02mol/L(恒温水浴箱中进行) pH6.0的磷酸氢二盐-柠檬酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研3-4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过四层纱布过滤，滤液供测定用。（如为液体样品，可直接过滤，取一定量滤液入容量瓶中，加入缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，备用。） 2.测定 （1）将“标准色”溶液滴于白瓷板的左上角空穴内，作为比较终点色的标准。 （2）在50ml的三角瓶中（或大试管中），加入2%可荣幸淀粉液20ml，加缓冲溶液5ml 在60°C水浴中平衡约4-5min，加入0.5ml酶液，立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取出反应液约0.25ml，滴于预先充满此稀碘液（约0.75ml）的调色空穴内，当空穴颜色由紫色变为棕红色，与标准色相同时，即为反应终点，记录时间T（min）. 五、计算 1g酶粉或1ml酶液于60°C、pH6.0的条件下，1h液化可溶性淀粉的克数，称为液化型淀粉酶的活力单位数。 酶活力单位=60/T*20*2%*n*1/0.5*1/m 式中 n:酶粉稀释倍数 60：1h(60min) 0.5:吸取待测酶液的量，ml; 20*2%:可溶性淀粉的量，g; T:反应时间，min; m: 酶粉取样量。 六、说明 1.全部时间控制在2- 2.5分钟，否则应改变稀释倍数，重新测定。 2.实验中，吸取2%可溶性淀粉及酶液的量必须准确，否则误差较大。 七、思考题 1.在测定酶活力的过程中，应注意什么问题？ 2. α-淀粉酶习惯单位的定义是如何规定的？ 3.诺维信公司α-淀粉酶和糖化酶的活力单位是如何规定的？

实验2 固定化糖化酶活力的测定 1 实验目的 （1）学习固定化糖化酶活力的测定方法。 （2）了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。 2 实验原理 糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉β-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉α-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉β-1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。 碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。 I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI 体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。 I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 3 仪器和试剂 3.1 主要仪器 吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。 3.2 试剂 （1）2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。 冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml 混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液 称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。 （5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （6）1mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸 5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。 （7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。 4 实验方法步骤 （1）固定化糖化酶的称量 称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL)，待用。 （2）酶活力的测定

糖化酶活力测定 1.原理 固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高，淀粉利用率就高。 可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。 2.试剂 （1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的可溶性淀粉2g（准确至0.001g），于50mL烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的烧杯中，并用20mL 水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配置使用。 （2）2.5g/L葡萄糖溶液 （3）斐林试剂 （4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6） a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。 b.mol/L 乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COOH·3H2O），溶于水并稀释至1000mL。 将a，b等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 （5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L。（6）1 mol/L NaOH 溶液。 3.测定步骤 （1）5%干曲浸出液制备 称取相当于5g的干曲的曲粉（准确至0.01g）［曲粉量（g）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL烧杯中，加水（90－5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min 搅拌1次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。 （2）糖化液制备 吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min 后，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。立即加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，以停止反应。再冷却到室温，用水定容至刻度线。此时溶液应呈碱性。 空白液制备：吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，先加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，再准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。冷却到室温，定容。此时溶液应呈碱性。 （3）糖分测定 斐林试剂法，先取适量糖化液于斐林试剂中，用标准葡萄糖溶液滴定。 4.计算 糖化酶活力定义：1g 干曲在35℃、pH4.6条件下，反应1h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖1mg 所需的酶量称为1个酶活单位（U/g）。 糖化酶活力（U/g）=（V0－V）×c×（100/5）×（100/10）×（1/5）×1000