传统的减毒或灭活疫苗可刺激机体产生强烈持久的免疫应答，但是存在一些安全隐患，同时无法有效应对具有高频突变特性的病原如人免疫缺陷病毒、流感等。亚单位疫苗易于生产、安全有效、理化性质稳定[1-3]，然而其免疫原性弱，需纳米尺度的抗原载体来递送以增强免疫应答的强度和广度。纳米颗粒载体被抗原呈递细胞偏好性地吞噬，促进其成熟并分泌多种细胞因子，引发免疫级联反应。此外，纳米载体表面展示的高度重复抗原直接交联B细胞受体，降低B细胞激活阈值，产生强烈持久的B细胞免疫应答[2]。作为一种纳米颗粒，病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)被广泛地应用于疫苗研发[4-5]。乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)就是一种可自发组装形成正二十面体的VLPs，构象上模拟天然乙肝病毒粒子，但不包含病毒遗传物质，生物安全性较高[5]，是疫苗研究中广泛使用的载体。

大多数病毒粒子表面的蛋白抗原在自然状态下高度重复地展示在其表面。抗原的这种有序重复的形式就是一种病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)能够有效地交联B细胞受体(B-cell receptors，BCRs)，向B细胞传递较强的激活信号，增强体液免疫应答。但是，目前关于疫苗载体表面重复抗原的密度对免疫应答影响的相关研究较少。我们已有的工作，利用Sortse A酶的转肽功能，把HBc VLPs开发成模块化纳米载体，可在纳米颗粒表面便捷、特异地展示不同的多肽或蛋白抗原。转肽酶Sortase A可特异性地识别暴露于HBc VLPs表面的LPETGG序列，断裂T和G之间的肽键，形成HBc-Sortase A中间产物。而后N端带有3个甘氨酸的抗原多肽或蛋白亲核攻击中间产物，替换下Sortase A，进而与HBc VLPs共价偶联，实现在VLPs表面展示外源抗原。我们前面工作发现降低抗原底物的浓度，会降低VLPs表面抗原的密度，但是诱导的体液应答水平是否受影响尚不清楚。在自然状态下一些人类病毒粒子表面的抗原密度不尽相同。例如，囊膜糖蛋白(Env)在HIV粒子表面的丰度很低，每个粒子大约只含有14个拷贝[6]。一个甲型流感病毒粒子表面的血球凝集素(HA)大约有500个拷贝，是非常密集的[7]。在人工合成的纳米颗粒疫苗方面，Matthew等研究发现，低抗原密度的聚苯乙烯纳米颗粒疫苗更有效地刺激抗体的产生[8]。因此，研究VLPs表面抗原密度与体液免疫应答之间的关系，具有较为重要的意义。

我们选取人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)[9-10]的抗原域AD-4蛋白[11-12]作为一个抗原表位的模型，首次研究了HBc VLPs表面抗原密度对抗体滴度的影响。研究发现，HBc VLPs表面AD-4抗原密度确实对免疫后特异性抗体滴度存在影响；当抗原密度为44.4%时，即HBc浓度：AD-4浓度为1:0.5时，不足以引起高滴度的抗体产生；当表面抗原密度为64.2%时，即HBc浓度：AD-4浓度为1:1时，HBc-AD-4 VLPs诱导的AD-4特异性抗体滴度与100%抗原密度的HBc-AD-4 VLPs所引起的抗体滴度相当；抗原密度大于64.2%时，引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而显著变化。这将为科学研究和工业化生产节约成本。我们的工作不仅可以节约抗原的使用量，而且为有效疫苗的开发提供理论指导。

将pET28a-HBc、pET28a-Sortase A、pET28a-AD-4重组载体[13]转化到E. coli BL21(DE3)plysS中后，挑单菌落，于20 mL LB培养基中扩大培养，摇过夜后全部接种到500 mL的含有50 μg/mL卡那霉素的LB中，37 ℃、240 r/min条件下培养至OD600的值为0.6-0.8时(约2 h左右)加入0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG) 500 μL，在25 ℃、240 r/min条件下诱导4 h使目的蛋白表达。4 ℃、5000 r/min离心20 min后收集菌体，加入30 mL的NT buffer (50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)重悬，工作5 s，停止7 s，35%强度条件下冰上超声破碎菌体12 min。之后将菌液匀浆在4 ℃、12000 r/min条件下离心30 min。留下上清纯化目的蛋白。

AD-4蛋白需要镍离子柱亲和层析纯化。该纯化全部在4 ℃条件下完成。将大肠杆菌裂解液上清(记为input)倒入镍柱中，混合30 min。收集流穿液，记为flowthrough (图 1中简写为flow)。之后分别用10 mL含有25 mmol/L、50 mmol/L咪唑的NT buffer清洗与柱子结合的杂蛋白，分别记为w1和w2，最后用5 mL含有250 mmol/L咪唑的NT buffer洗脱，得到目的蛋白，将洗脱液在1 L的NT buffer中4 ℃条件下透析过夜。

Sortase A蛋白需要两步纯化，镍离子柱亲和层析纯化后再进行蔗糖密度梯度离心纯化。用NT buffer配置10%、20%、30%、40%、50%(质量/体积)的5份蔗糖溶液，取每个浓度溶液2 mL，浓度由低到高依次用长针头注射器从底部加入SW 41超速离心管，最后加入已透析好的HBc蛋白样品2.5 mL。之后在4 ℃、39000 r/min条件下超速离心2 h，加速、减速均为9。超离后，每隔1 mL取样进行SDS-PAGE分析。

HBc蛋白也需要两步纯化，先进行硫酸铵盐析法得到HBc蛋白沉淀，重悬后再使用蔗糖密度梯度离心法得到较为纯净的蛋白。向大肠杆菌裂解液上清中加入硫酸铵(每毫升裂解上清中加入0.2 g硫酸铵)。在4 ℃条件下振荡混匀，使硫酸铵充分溶解，HBc蛋白盐析沉淀在管底。之后在4 ℃、12000 r/min条件下离心30 min，倒掉上清后贴壁加入4 mL的NT buffer，在4 ℃振荡使之混匀，使HBc蛋白沉淀自然溶解，最后使HBc溶解液在1 L的NT buffer中4 ℃条件下透析过夜。第二步，HBc蛋白需要进行蔗糖密度梯度离心纯化。步骤同上，结束后每隔1 mL取样进行SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳分析。

配制7个转肽反应体系[13]，每个体系2 mL。分别加入HBc蛋白(反应浓度为40 μmol/L)，Sortase A蛋白(反应浓度为50 μmol/L)，以及AD-4蛋白(反应浓度分别为20、40、80、120、160、200、240 μmol/L)，即HBc浓度：AD-4浓度分别为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。最后加入CaCl2作为催化剂(反应浓度为2 mmol/L)，体系不足2 mL的用NT buffer补齐至2 mL。室温条件下转肽反应2 h。

将小鼠随机分成9组，每组5只，设置1个PBS(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4 10 mmol/L，KH2PO4 2 mmol/L，pH 7.4)对照组，1个不含AD-4蛋白的HBc蛋白对照组，以及7个不同AD-4抗原密度的HBc-AD-4 VLPs试验组。采用腹腔注射的方法，每只小鼠注射10 μg相应的蛋白(PBS对照组接种相应体积的PSB溶液)，每隔2周接种1次，共接种3次。每次接种前，眼眶内眦取血100 μL左右，把血样置于37 ℃环境中，凝血后，4 ℃、3000 r/min条件下离心5 min，取血清待检测。

用间接酶联免疫吸附法(ELISA)来检测特异性抗体的滴度。将浓度为0.2 ng/μL的AD-4蛋白溶液包被96孔板，50 μL/孔4 ℃过夜孵育。之后用含有1/1000体积吐温的PBS(PBST)洗涤3遍，再用含5%脱脂乳PBS溶液封闭96孔板，37 ℃封闭1 h，之后PBST洗3遍。再将一系列的1%脱脂乳梯度稀释的血清样品(分别按1/102、1/103、1/104、1/105、1/106、1/107的比例稀释血清)以50 μL/孔的体积加入96孔板，在37 ℃孵育2 h。用PBST再次洗涤3遍后，用含1%脱脂乳的PBST以1:5000的比例稀释山羊抗鼠IgG，以50 μL/孔的体积加入96孔板，在37 ℃孵育1 h。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB显色液50 μL，显色后，用1 mol/L硫酸终止显色反应，50 μL/孔。使用酶标仪测定ELISA的OD450数值，数值大于0.2时的稀释度即为该小鼠抗体滴度。

病毒样颗粒表面抗原密度确定：转肽反应结束后，取样经SDS-PAGE，考马斯亮蓝(Coomassie blue R250)染色、脱色后，电泳结果经天能凝胶成像系统拍照，利用ImageJ软件，对HBc和AD-4的转肽产物条带的灰度进行测定，计算转肽比例。

ELISA结果利用GraphPad Prism 6.0软件统计分析并绘制图表。各组间比较采用One-way ANOVA检验法，数据表示为平均值±标准偏差。P＞0.05时认为没有显著性差异，P＜0.05时认为有显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

将pET28a-HBc、pET28a-Sortase A、pET28a-AD-4重组载体分别转化到E. coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中后，挑取单菌落，在LB培养基中培养，经IPTG在25 ℃低温诱导后，离心收集菌体，菌体经超声破碎后按相应的方法分别纯化AD-4、Sortase A、HBc蛋白(图 1仅给出最终的纯化结果)。如图 1所示，三种蛋白均成功表达。经SDS-PAGE分析，AD-4镍离子柱亲和层析纯化获得的目的蛋白大小为16 kDa。采用蔗糖密度梯度离心法纯化相应蛋白时，蔗糖密度梯度溶液会形成连续浓度梯度，图 1中用灰色的直角三角形表示蔗糖的浓度梯度，浓度为10%-50%，灰色越深代表蔗糖浓度越高，按照密度从低到高的顺序，依次取样，每次从超离管中取1 mL，标号1-12号，再从1-12号管中取出适量蛋白样品进行SDS-PAGE检测。实验发现，Sortase A主要存在于低蔗糖密度的1-4号组分中，分子量25 kDa，聚合形式的Sortase A蛋白因为密度较大，则存在于高蔗糖密度的6-9号组分中。基于我们之前的研究[13]，由于普通的HBc病毒样颗粒不能将LPETGG末端暴露在表面，所以采用断裂HBc蛋白进行实验，即在HBc的免疫显性的c/e1环区插入氨基酸序列LPETGG以及终止密码子，将其氨基酸序列分成两部分，N端第1-79位氨基酸称N core-LPETGG，C端第80-183位氨基酸称C core，断裂HBc蛋白仅氨基酸序列断裂开来，表达后的N core-LPETGG和C core仍能自发组成病毒样颗粒[14]。如图 1-C所示，N core-LPETGG大小约为10 kDa，C core大小约为18 kDa，且同时存在于高蔗糖密度的7-10号组分中，表明N core-LPETGG和C core确实组装形成了VLPs。经琼脂糖凝胶电泳，发现断裂HBc能被溴化乙锭(EB)染色[14]，表明VLPs结合上了宿主核酸。

Sortase A是一种转肽酶[15]，它可特异性地识别N core上的暴露于HBc表面的LPETGG序列，断裂T和G之间的肽键，形成N core-Sortase A中间产物。而后N端带有3个甘氨酸的抗原AD-4(本文涉及的AD-4蛋白，均指N端带有3个甘氨酸的AD-4)亲核攻击中间产物，替换下Sortase A，进而与N core共价偶联，生成转肽产物N core-AD-4[13]，由于断裂HBc的N core和C core仍能自发组装成病毒样颗粒的结构[15]，这样就可以实现在VLPs表面展示不同密度的外源。我们已发表的工作[13]发现，当抗原浓度为抗体浓度的6倍时，再增加抗原浓度，转肽反应的效率不再明显提升。另外，当AD-4的量过少时，会导致生成的转肽产物N core-AD-4过少，SDS-PAGE难以检测到条带。因此，本研究设定了7组不同浓度HBc和AD-4的反应体系，即HBc浓度：AD-4浓度分别为1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6。之后，我们用考马斯亮蓝对SDS-PAGE结果进行染色，脱色后，用ImageJ软件分析转肽产物N core-AD-4的灰度值。如图 2-A，转肽产物N core-AD-4的大小为26 kDa，我们发现随着AD-4浓度的增加，N core-AD-4的生成量也呈现出增加的趋势，表明HBc-AD-4病毒样颗粒表面的AD-4抗原密度也在增加。我们将HBc浓度：AD-4浓度=1：6时的VLPs抗原密度定义为100%密度，即一个VLPs上的LPETGG位点全部被AD-4占据；其余组别分别用相应转肽产物N core-AD-4的灰度值除以1：6组别的灰度值，从而求得相对抗原密度的比例。HBc浓度：AD-4浓度是1：0.5至1：6的7个实验组的抗原密度分别为44.4%、64.2%、75.0%、79.6%、84.7%、95.0%、100%。如图 2-B所示。之后按此比例放大至2 mL，以制备不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs。

配制7个转肽反应体系，分别加入HBc蛋白、Sortase A蛋白以及AD-4蛋白，最后加入CaCl2作为催化剂，体系不足2 mL的用NT buffer补齐。室温反应2 h后进行蔗糖密度梯度离心，按照密度从低到高的顺序，依次取样，进行SDS-PAGE检测。如图 3所示，转肽产物N core-AD-4大小约26 kDa，C core大小仍约为18 kDa。转肽产物N core-AD-4均主要分布在7-10号的组分中，表明虽然VLPs表面抗原密度不同，但是对VLPs粒子整体的密度大小并未产生明显影响。另外，随着AD-4浓度的增加，转肽产物N core-AD-4的生成量也呈现出增加的趋势，表明不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs已成功制备。由于在44.4%抗原密度时VLPs中包含的N core-AD-4非常少，SDS-PAGE难以检测到条带，故44.4%抗原密度的VLPs制备结果没有给出。制备结束，收集好含有相对纯净的转肽产物的组分，在PBS中透析过夜，以除去蔗糖。之后使用蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，最后放于-80 ℃冰箱冻存。

为了探索不同抗原密度病毒样颗粒对抗体滴度的影响，设定PBS、HBc病毒样颗粒2个阴性对照组，设置7个实验组，HBc浓度：AD-4浓度分别为1：0.5至1：6(如1.2.2蛋白转肽反应体系的配制中所述)，每隔2周对小鼠接种1次，共接种3次。采集血浆后，使用间接ELISA的方法检测血清中AD-4特异性抗体滴度，采取终点(OD450＞0.2)读值法确定抗体的滴度。小鼠在初次免疫后即可发现AD-4抗体转阳，如图 4-A所示，在HBc浓度：AD-4浓度为1：5时，抗体滴度最高，为103.8，与HBc对照组差异极显著(P＜0.001)；其次为1：2组别，抗体滴度为103，与HBc对照组有显著性差异(P＜0.05)；而其余实验组组别与HBc对照组均没有明显差异(P＞0.05，用n.s.表示)(图 4-A中仅标出HBc与实验组1：0.5、1：2、1：5组别的统计学关系)。二次加强过后，所有组别小鼠产生的抗体应答水平有所升高。其中，7个实验组的抗体滴度均极显著高于HBc对照组(P＜0.001)，然而1：0.5实验组抗体滴度相对较低，为103.03，与滴度最高的组别1：4(抗体滴度为104)存在显著性差异(P＜0.05)(图 4-B中仅标出HBc与实验组1：0.5、1：4组别的统计学关系)。第三次免疫过后，7个实验组的抗体滴度仍然极显著高于HBc对照组(P＜0.001)，1：0.5组别抗体水平略有上涨但抗体滴度仍然较低，为103.42，其余实验组别抗体滴度也均有所升高，1：1至1：6的6个实验组间抗体滴度无明显差异(P＞0.05)，其中1:2组别抗体滴度最高，为104.65，其中1:5组别抗体滴度最低，为104.3。1:2抗体滴度极显著高于1:0.5组别(P＜0.001)，而1:5组别抗体滴度也显著高于1:0.5组别(P＜0.05)。以上结果表明，HBc VLPs表面抗原密度确实对免疫后特异性抗体滴度存在影响；当HBc表面抗原密度为44.4%时，即HBc浓度：AD-4浓度为1:0.5时，不足以引起高滴度的抗体产生；当HBc表面抗原密度为64.2%时，即HBc浓度：AD-4浓度为1:1时，病毒样颗粒诱导的特异性抗体滴度与展示高密度抗原的VLPs所引起的抗体滴度相当；抗原密度大于64.2%时，引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而显著变化。

已有研究表明，抗原展示于纳米颗粒表面的疫苗更利于加强体液免疫应答[1, 12, 16]。但是，纳米颗粒疫苗表面抗原密度对免疫应答的影响缺乏相关的研究[2]。曾有报道用二硝基苯半抗原交联的聚丙烯酰胺、鸡卵溶菌酶修饰的羊红血球以及联合抗原和佐剂研究抗原密度对宿主免疫反应的影响[11-12, 17]。也有实验表明，利用生物素-链霉亲和素系统交联抗原蛋白的聚苯乙烯纳米颗粒疫苗，低密度的抗原比高密度的抗原更有效地活化B细胞，诱导更高水平的体液免疫应答[8]。表明纳米颗粒表面的抗原密度对于体液免疫反应的引发是至关重要的。

在本研究中，我们以更加接近天然病原体的病毒样颗粒为实验材料，对这一关键问题作了进一步研究和探讨。我们利用转肽酶Sortase A介导的转肽功能，通过调节抗原表位底物浓度，将不同密度的AD-4抗原展示至HBc VLPs表面。实验结果表明，与已经报道的聚苯乙烯纳米颗粒疫苗不同，基于HBc的病毒样颗粒疫苗诱导的抗体滴度与其表面抗原密度存在相关性，但是在达到一定的抗原密度后所诱导产生的抗体滴度趋于饱和，即继续提高抗原密度不能诱导更强的抗体反应。具体的，44.4%抗原密度的VLPs不能引起较高水平的抗体滴度，64.2%至100%抗原密度的VLPs能够诱导产生相当的较高的抗体滴度，且此时诱导产生的抗体滴度与VLPs表面抗原密度无关。该发现将为开发病毒样颗粒疫苗提供理论指导。

至于纳米颗粒表面的抗原密度是如何影响免疫反应的还有待进一步研究。我们推测有可能纳米颗粒表面的抗原蛋白密度影响了定居在免疫位点和引流淋巴结的免疫细胞对抗原的获取和处理。另外也有可能是B细胞表位在纳米载体低密度展示的情况下变得更容易被利用，因此容易引发更强的抗原特异性反应，B细胞受体可能会通过对信号的放大增强辅助性T细胞的效力[18-19]。遗憾的是，我们在试验中发现免疫不同AD-4抗原密度的HBc VLPs小鼠的抗血清对于HCMV没有中和活性，这可能是本实验系统的一个缺陷，后续的实验将在如何提升不同密度病毒样颗粒所诱导的中和抗体活性方面做进一步研究。