本发明属于生物，尤其是一种“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的鉴定方法和引物对及应用。

背景技术：

1、受猪周期、非洲猪瘟及其它疫病的影响，当生猪存栏有大幅度变化，尤其在能繁母猪的数量下降，生猪存栏减少时，将导致猪价暴涨。由于利益的驱使，一些养殖企业以二元猪(大白猪和长白猪杂交后代)充当“外三元”(大白猪、长白猪、杜洛克猪)纯种猪，二元回交猪(大白猪和长白猪杂交后代再与大白猪或者长白猪杂交)充当外三元纯种猪，三元猪充当二元猪售卖。有的养殖场(户)，利用自繁的三元猪留种，进行后续养殖生产。这些猪都不同程度的存在发情不明显、屡配不孕，产仔数低的特点，导致我国猪群生产成绩降低，种质退化。所以“外三元”猪的种质鉴定技术，具有非常大的市场需求和应用空间。

2、目前种质鉴定的方式包括传统表观鉴定和分子鉴定。传统表观鉴定主要靠经验，是通过对毛色、体型及耳型进行表观的区分。但是由于养殖场(户)的技术人员或者农民并不能系统掌握“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的所有特征，导致传统鉴定方式无法准确判断猪种。也正是因为这样，很多不良商家通过以次充好的方式售卖种猪。种猪的分子鉴定方面，“外三元”猪种质的分子鉴定方法报道较少，非常标志性的突变位点并没有系统报道。目前报道的猪品种鉴定的基因大都是外种猪和国内猪种区别的鉴定。于辉等人采用pcr-rflp分型方法，探讨3个引进种猪sla-dqa基因外显子2的群体遗传结构，比较分析三品种猪的群体遗传指标，他们在ecorⅰ位点上大白猪仅有bb型和ab型，在aluⅰ位点上长白猪仅有nn型，杜洛克猪基因型频率mn高于mm和nn(于辉,李建东,赵海全等.三品种外种猪sla-dqa基因的pcr-rflp分析[j].中国畜牧杂志,2010,46(09):14-17.)。岳阳等人对太湖流域7个品种和西方5个品种猪种进行简化基因组测序，筛选出了5个小梅山猪与其他品种猪不同的snp位点，同时采用sanger测序进行验证，进而建立了小梅山猪及其制品的snp分子标记鉴定方法，该方法可用于小梅山猪与太湖流域其他6个品种及常见西方品种猪的鉴定区分(岳阳.基于单核苷酸多态性标记鉴别太湖流域地方品种猪及其制品的方法研究[d].上海交通大学,2019.doi:10.27307/d.cnki.gsj tu.2019.003893.)。目前商业化的全基因组芯片测序，比对获得猪源信息的方法较为常见。且鉴定是否具有杜洛克猪血缘，或者通过黑斑基因鉴定来推断的“外三元”纯种猪的方法较多。能用来鉴别大白猪、长白猪、杜洛克猪、二元、三元及多元回交猪的基因型非常少，也没有系统有效的方案。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的鉴定方法和引物对及应用。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

3、一种用于“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的引物对，所述引物对包括扩增含有ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点中的一种或两种以上的引物对，其中扩增含有ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点的pcr所有引物对，包括但不限于seqid no.1-6所示：

4、其中，扩增含有ssc6:110653413t>c位点的引物对中的上游引物为seq id no.1(5'aatctccgactctgg 3')，下游引物为seq id no.2(5'gagctgcaaatgtgag 3')；

5、扩增含有ssc11:47494227t>g位点的引物对中的上游引物为seq id no.3(5'gggtgggaaggaagtct 3')，下游引物为seq id no.4(5'aagccagacggtgaagat 3')；

6、扩增含有ssc13:57293969a>g位点的引物对中的上游引物为seq id no.5(5'ttacggagtagaagcaa 3')，下游引物为seq id no.6(5'gatggcaggaaagaaa 3')。所述ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点均为sus scorfa11.1版的基因组位置和具体突变。

7、包括如上所述的引物对的“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的种质鉴定试剂盒。

8、一种利用如上所述的引物对的单snp位点鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述方法利用所述的引物对，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序，获得测序分型结果；通过测序分型结果获得每头猪的ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点的突变类型；这三个位点的突变类型即能够用于鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪。

9、这些位点的特征及鉴定原则为：

10、通过ssc6:110653413t>c单位点的snp分型结果分析：tt型是长白猪纯种或大白猪纯种、二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tc型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；cc型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪(图1)。

11、通过ssc11:47494227t>g单位点的snp分型结果分析：tt型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；tg型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪(图2)。

12、通过ssc13:57293969a>g单位点的snp分型结果分析：aa型是大白猪纯种或杜洛克猪纯种、三元猪、多元回交大白猪、三元及以上多元回交杜洛克猪；ag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；gg型是长白猪纯种、多元回交长白猪(图3)。

13、一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc6:110653413t>c位点和ssc11:47494227t>g位点，所述引物对为seq id no.1-4，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t>c位点和ssc11:47494227t>g双位点联合分析特征及选育原则为(附图1，2)tttt型是大白猪纯种、多元回交大白猪；tttg型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；cctt型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；cctg型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tctt型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tctg型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。

14、一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc6:110653413t>c位点和ssc13:57293969a>g位点，所引物对为seq id no.1-2、seq id no.5-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t>c位点和ssc13:57293969a>g位点双位点联合分析特征及选育原则为(附图1，3)：ttaa型是大白猪纯种、多元回交大白猪；ttag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；ttgg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；ccaa型是杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcaa型是三元猪、三元及以上多元回交大白猪或杜洛克猪；tcag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tcgg型是三元及以上多元回交长白猪。

15、一种利用如上所述的引物对的双snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述双snp位点为ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点，所述引物对为seq id no.3-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc11:47494227t>g和ssc13:57293969a>g双位点联合分析特征及选育原则为(图2，3)：ttaa型是大白猪纯种、杜洛克猪纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；ggag型是多元回交长白猪；gggg型是长白猪纯种、多元回交长白猪；tgaa型是三元猪，三元及以上多元回交杜洛克猪、多元回交大白猪；tgag型是二元猪、三元猪、多元回交猪(如长白猪、大白猪或杜洛克猪)；tggg型是多元回交长白猪。

16、一种利用如上所述的引物对的三snp位点联合鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法，所述三snp位点为ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点，所述引物对为seq id no.1-6，以每头猪的dna为模板进行pcr扩增，将扩增获得的产物进行测序；测序获得测序序列、测序分型结果。ssc6:110653413t>c、ssc11:47494227t>g和ssc13:57293969a>g三位点联合分析特征及选育原则为(图1，2，3)：ttttaa型是大白纯种猪、多元回交大白猪；ttttag型是多元回交大白猪；tttgaa型是多元回交大白猪；tttgag型是二元猪、多元回交长白猪或大白猪；tttggg型是多元回交长白猪；ttggag型是多元回交长白猪；ttgggg型是长白纯种猪、多元回交长白猪；ccttaa型是杜洛克纯种、三元及以上多元回交杜洛克猪；ccttag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪；cctgag型是三元及以上多元回交杜洛克猪；tcttaa型是三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tcttag型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgaa型是三元猪、三元及以上多元回交杜洛克猪或大白猪；tctgag型是三元猪、三元及以上多元回交猪(如杜洛克猪、长白猪或大白猪)；tctggg型是三元及以上多元回交长白猪；tcggag型是三元及以上多元回交长白猪；tcgggg型是三元及以上多元回交长白猪。

17、如上所述的引物对在猪种质鉴定中的应用。

18、本发明取得的有益效果为：

19、1、本发明是通过分析比较大群全基因组芯片数据，挑选杜洛克猪、长白猪和大白猪特有的突变位点，利用多品系的“外三元”纯种猪、二元猪和三元猪等进行验证。最终获得“外三元”猪种鉴定的有效突变位点并制定鉴定方案。为我国“外三元”猪的种质净化提供技术支持，促进养猪生产持续稳定发展。

20、2、本发明主要解决了“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的种质鉴定问题。重点考察了ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点的单snp位点、双snp位点联合和三snp位点联合对“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪种质鉴定的方法、效果及应用。本发明是利用猪常染色体的三个猪种特异性的突变位点联合分析，鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法和引物对，是一种分子育种技术、引物对及结果的应用。

21、3、本发明公开了一种通过snp分型技术确定的ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点三突变位点联合分析鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法和引物对。本发明同时也公开了ssc6:110653413t>c位点、ssc11:47494227t>g位点和ssc13:57293969a>g位点扩增的引物及利用该引物进行检测、分析和鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪的方法。此引物、方法和方案利用分子生物学基因检测技术在6、11、13号常染色体找出突变位点以鉴定“外三元”纯种猪、二元猪、三元猪和多元回交猪，解决市场上猪的种质混乱等问题。该方法准确度高，操作简单，在猪的种质鉴定方面具有很高的实践应用价值。