β-羟基-α-氨基酸是一类重要的非天然氨基酸，是合成复杂药物分子、天然产物和生物活性物质的重要手性砌块，在医药、食品和精细化工等领域有着广泛的应用。图 1中列出了基于该结构开发的几种上市药物，如兽用广谱抗生素氟苯尼考(Florfenicol) 和甲砜霉素(Thiamphenicol)、治疗帕金森症的屈昔多巴(Droxidopa)、全球首个口服戈谢病治疗药物依利格鲁司他(Eliglustat) 等[1-2]。β-羟基-α-氨基酸在α-碳和β-碳上有连续的2个手性中心，其双手性中心的高效制备一直是合成化学研究的难点和热点。

鉴于β-羟基-α-氨基酸的重要性，近年来报道了多种不对称合成方法[1]，如动态动力学拆分[2]、不对称氢化[3]、Sharpless不对称环氧化[4]、Aza-Claisen重排[5]等。这些方法为制备光学纯β-羟基-α-氨基酸提供了非常有用的工具，但也同时存在一个或多个方面的不足，如反应条件苛刻、立体选择性不高、合成路线较长和重金属残留等。

酶法合成高附加值手性化合物，已成为绿色化学和化工发展的重要趋势之一[6]。苏氨酸醛缩酶(Threonine aldolases，TAs) 以5′-磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5′-phosphate，PLP) 为辅因子，可逆催化醛与甘氨酸羟醛缩合生成β-羟基-α-氨基酸，其显著优势在于一步反应即可构建双手性中心，不需要保护和去保护步骤，不产生副产物，是最直接、最吸引人的合成方法之一。目前，已报道的TAs同时生成非对映异构体threo-β-羟基-α-氨基酸和erythro-β-羟基-α-氨基酸，即在α-碳具有高度立体选择性，但普遍不能严格控制β-碳立体选择性，导致产物的非对映体过量值(Diastereomeric excess，de值) 较低[7]。已发表的TAs综述性文献请参见文献[8-10]，本文系统性地总结了TAs在基因挖掘、催化机理、分子改造及合成应用等方面的研究进展，着重阐述了TAs所面临的关键科学问题，以及近5年研究报道的一些解决方案，以期促进该研究领域的进一步发展，建立高效的光学纯β-羟基-α-氨基酸的生物合成方法。

基于苏氨酸的α-碳立体选择性，TAs可分为L-苏氨酸醛缩酶(L-TA) 和D-苏氨酸醛缩酶(D-TA) (图 2)。根据所生成的l/D-苏氨酸的β-碳立体选择性，可细分为L-苏氨酸醛缩酶(L-TA，EC 4.1.2.5)，偏好L-苏氨酸、对L-别苏氨酸(L-allo-苏氨酸) 活性较低；L-allo-苏氨酸醛缩酶(L-allo-TA，EC 4.1.2.49)，偏好L-allo-苏氨酸、对L-苏氨酸活性较低；低特异性L-苏氨酸醛缩酶(L-low-TA，EC 4.1.2.48)，对L-苏氨酸和L-allo-苏氨酸无明显偏好；而对于D-苏氨酸醛缩酶，目前仅报道了D-low-TA (EC 4.1.2.42)。另外，苯丝氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.26)，对L-苏氨酸和L-allo-苏氨酸均有活性[11]，亦可归类为苏氨酸醛缩酶。TAs的分类是基于苏氨酸的立体选择性，但与其对芳香族β-羟基-α-氨基酸的立体选择偏好性并不完全一致，Fesko等发现L-TA、L-allo-TA和L-low-TA催化合成L-β-苯丝氨酸以L-threo/erythro混合物形式存在，但均以L-threo构型为主[12]。

TAs在自然界中分布广泛[9-10, 13]，L-TA已报道有大肠杆菌Escherichia coli、天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor等来源[14-23]；L-allo-TA已报道有简氏气单胞菌Aeromonas jandaei、海栖热袍菌Thermatoga maritime等来源[16, 24-26]；L-low-TA来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等[12, 27-32]。D-low-TA目前报道较少，已报道有木糖氧化产碱菌Alcaligenes xylosoxidans、水稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae等来源[12, 16, 33-37]。

L-TA和D-TA催化反应类似，但两者在进化来源和结构上并不相似，前者属于天冬氨酸转移酶家族，后者属于丙氨酸消旋酶家族[38]。序列相似度网络和系统发育分析将L-TA分成2个亚家族，一个亚家族包括原核和真核生物来源，如A. jandaei、S. cerevisiae等来源，偏好L-allo-苏氨酸；另一个亚家族仅含有原核生物来源，如P. putida、Pseudomonas sp. 等来源，偏好L-苏氨酸[39]。多序列比对发现两个亚家族之间相似性较低，但均具有部分保守位点，以A. jandaei来源的L-allo-TA为例，包括与PLP形成Schiff碱的Lys199，与PLP和底物相互作用的His85、His128、Arg171和Arg313。D-TA同样具有形成Schiff碱的保守位点Lys59 (以A. xylosoxidans来源的D-low-TA为例)，与PLP和底物相互作用的Gln81，Arg157、Tyr187和Ser252，以及绑定二价金属离子的His347和Asp349。

多个TAs晶体结构得到解析，通过晶体结构分析、突变实验及反应动力学分析等研究，提出了催化反应机理。L-TA和D-TA在三维结构和催化机理上均有较大差异，前者是同源四聚体、属于PLP依赖的Ⅰ类折叠酶，后者是同源二聚体、属于PLP依赖的Ⅱ类折叠酶。2002年，Kielkopf等首次解析了T. maritime来源的L-low-TA晶体结构(PDB：1M6S)，该酶具有4个活性中心的同源四聚体，每个亚基含有2个结构域，位于四聚体中间的大结构域由7个α/β结构组成，小结构域由C末端和N末端的3–4个α-螺旋和β-折叠组成[26]。含有L-allo-苏氨酸和甘氨酸的共结晶结构(PDB：1LW4和1LW5) 揭示，Lys199的氨基与供体底物形成Schiff碱中间体而实现对供体底物的活化，进而生成亲核的烯胺，选择性地进攻受体羰基。活性中心His83和His125起到了较为关键的作用，His83介导了L-allo-苏氨酸羟基的去质子化，L-苏氨酸裂解过程中起到催化碱作用的可能是His125及其附近带负电荷的水分子。

di Salvo等解析E. coli来源的L-low-TA (PDB：4LNJ)，整体结构与T. maritime来源的相似，酶活性中心位于亚基结合界面处(图 3A–B)，由一个亚基和与之相邻两个亚基的loop共同构筑而成(图 3C)[40]。反应机理如图 3D所示，PLP首先与酶活性中心Lys197的氨基形成Schiff碱中间体；底物甘氨酸进入活性中心，PLP与Lys197之间的键断裂，与底物形成新的中间体，后者促进了甘氨酸的α-碳去质子化，当亲核攻击受体乙醛进入活性中心，形成含有C-C的醌式中间体；最后PLP和Lys197重新生成Schiff碱中间体，并释放产物苏氨酸。在pH 5.6时，α-氨基和羧基处于颠倒的位置，PLP无法和Lys197形成内部亚胺，从而阻断底物被亲核攻击[41]。值得注意的是，活性中心有多个水分子参与催化反应，其中一分子水与PLP磷酸基团、Ser196和Gly204形成氢键；一分子水与PLP磷酸基团、His126、Lys222和Arg229以及苏氨酸β-羟基相互作用。含有L-丝氨酸和L-苏氨酸的共结晶结构(PDB：4LNL和4LNM) 表明His83和His126在反应中并没有起到催化碱的作用，两个组氨酸残基与活性中心的水分子形成配位，增强水的碱性使其作为催化碱。His83和His126在影响产物立体选择性上发挥了一定作用，突变体H83F和H126F均提高了对L-苏氨酸的偏好性，但不能严格控制产物的立体选择性。由于活性中心空腔较大，易于容纳位阻较小和较大的底物，底物的识别和产物的立体选择性是由与底物相互作用的氨基酸残基及附近的水分子共同构筑的酶活中心微环境所决定的，而非某一个或几个氨基酸所决定的，这加大了分子改造L-low-TA的难度。

Qin等筛选A. jandaei来源L-allo-TA的随机突变体库3 000余个突变体，获得突变体H128Y/S292R对L-苏氨酸和L-allo-苏氨酸的活性分别提高了8.4和2.0倍[42]。H128Y和S292R对L-allo-苏氨酸的kcat/Km值相似，而H128Y对L-苏氨酸的kcat/Km值是S292R的14.5倍，表明H128Y对提高L-苏氨酸活性起到主要作用。野生型和双突变体的晶体结构(PDB：3WGB和3WGC) 表明H128突变成Tyr后，残基侧链从活性位点移出4.2Å，并与产物L-苏氨酸的甲基形成疏水作用。进一步将H128突变成其他疏水性氨基酸，也通过形成疏水作用而提高L-苏氨酸的活性。不过S292R是如何起作用的，这还并不清楚。His85和His128附近的Glu90和Asp126突变成Ala后几乎丧失活性或改变底物偏好性，可能在酶活中心的氢键网络构建和底物识别中起到了协助作用，这与E. coli来源的L-low-TA的底物识别和立体选择性受酶活中心微环境显著影响是相一致的。

Uhl等首次解析了A. xylosoxidans来源的D-low-TA晶体结构(PDB: 4V15) 为同源二聚体，每个亚基含有2个结构域，大结构域由8个α/β-桶结构组成，是典型的丙氨酸消旋酶类似结构；小结构域由C末端和N末端的8个β-折叠组成[43]。辅因子Mn2+结合在PLP附近，与Ser252、Asp321、His347和Asp349这4个氨基酸残基相互作用。鉴于未能获得含有产物的共结晶，将D-β-苯丝氨酸对接到活性中心，Mn2+在催化过程中作为关键Lewis酸，与底物β-羟基相互作用并促进His193和水分子介导的去质子化过程。叠合该D-low-TA和T. maritime来源的L-low-TA活性中心，以辅因子PLP为镜像平面，底物β-羟基的去质子化分别由处于re-face的His193和处于si-face的His125所介导，两者呈现镜面对称(图 4)。另外，来源于莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的D-low-TA也获得了晶体，但是尚未解析出结构和催化机理[44]。

从原子经济性和环境影响角度考虑，以廉价的非手性甘氨酸和醛为底物，在温和条件下TAs催化一步反应即可构建β-羟基-α-氨基酸的双手性中心，是非常有潜力的绿色合成方法之一。表 1中列举了详细研究催化性质和底物谱的TAs。

Kimura等首次系统性地研究了E. coli来源的L-low-TA和X. oryzae来源的D-low-TA的脂肪醛、芳香醛和杂环醛底物谱及其立体选择性[37]。以脂肪醛和芳香醛的代表性底物乙醛和苯甲醛为例，E. coli来源的L-low-TA催化反应3 h，生成以L-erythro为主的苏氨酸(转化率35%，de > 99%) 和以L-threo为主的苯丝氨酸(转化率3%，de值为42%)；延长反应时间至24 h，转化率分别提高至40%和9%，而de值却下降至82%和20%。该酶催化短链脂肪醛偏好生成L-erythro产物，而催化芳香醛偏好生成L-threo产物。无论脂肪醛还是芳香醛，X. oryzae来源的D-low-TA合成产物均以D-threo为主。

Pseudomonas sp.来源的L-low-TA和A. xylosoxidans来源的D-low-TA的芳香醛和脂肪醛底物谱也进行了详细的研究[45-46]。L-low-TA在5–40 ℃范围内催化合成苯丝氨酸的de值没有明显变化为98%，升高温度de值会显著降低。L-low-TA在较宽泛的pH范围内(pH 5.5–8.0) 均表现出较高活性，而D-low-TA仅在pH 9.5展现出较高活性。苯环上取代基团的电负性和位阻效应影响着TAs的活性和立体选择性，吸电子取代基团的活性和选择性要优于供电子取代基团的芳香醛。其中，L-low-TA合成l-threo-2-氯苯丝氨酸(de值为52%)，l-threo-3-溴苯丝氨酸(de值为55%) 和l-threo-4-甲砜基苯丝氨酸(de值为53%) 取得了较好的立体选择性控制；最优化条件下，D-low-TA可高效构建d-threo-苯丝氨酸(de值为98%)，d-threo-2-氟苯丝氨酸(de值为95%) 和d-threo-4-甲砜基苯丝氨酸(de值为99%) 的双手性中心。

为了阐明TAs催化过程中立体选择性的变化趋势与规律，Shibata等探究了来源于土生假丝酵母Candida humicola的L-low-TA催化苄氧基丁醛和甘氨酸在动力学和热力学控制下产物立体选择性的变化，15 min时以L-erythro产物为主；延长反应时间使其处于热力学控制，L-threo产物转化率大幅提高，成为主要产物[29]。Fesko等剖析了L-TA、L-allo-TA、L-low-TA和D-low-TA催化合成L-β-苯丝氨酸过程中立体选择性的变化，反应1 min时处于动力学控制，产物α-碳和β-碳立体选择性较好，分别倾向于以L-threo、L-erythro、L-erythro和D-threo为主要产物；当动力学和热力学产物达到平衡，产物均以threo-β-苯丝氨酸为主，de值下降到20%左右[12]。不同来源的TAs合成产物的立体偏好性并不相同，动力学控制下产物的非对映异构体比例取决于每种异构体合成的能垒，而热力学控制下产物构型偏好性取决于热力学稳定性。一般来讲，处于动力学控制可获得较高的de值但转化率较低，处于热力学控制产物的转化率得到提高但de值显著下降。

很长一段时间，TAs催化羟醛缩合反应都是以甘氨酸为供体，随着研究深入发现也能利用一些非天然供体。Fresko等首次报道了Pseudomonas sp. 来源的D-low-TA和A. jandaei来源的L-allo-TA能以丙氨酸做供体，生成α-碳上有双取代的氨基酸衍生物[50]。以上述2个基因为探针，进一步基因挖掘获得了更多类似的TAs，供体底物进一步扩展至丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、2-氨基丁酸、亮氨酸和缬氨酸等[16, 50]。

近年来，详细研究了多个不同生物来源TAs的底物谱，涉及多种脂肪醛、芳香醛及杂环醛，普遍不能严格控制β-碳立体选择性，导致产物的de值较低[51]。另一方面，由于羟醛缩合反应可逆，为了提高转化率，通常需加入8–10当量供体底物来推动反应平衡朝向合成方向，反应完成需要回收过量的供体底物[52]。较低的de值和转化率是TAs在进一步合成应用中所面临的巨大挑战。

天然来源TAs合成β-羟基-α-氨基酸及其衍生物存在活性、稳定性和立体选择性等方面的不足，尤其是不能高效构建产物的双手性中心[53-54]。一方面，复杂的酶活中心微环境导致立体选择性控制机理不清晰，使得理性设计和半理性设计掣肘；另一方面，羟醛缩合反应受限于动力学和热力学控制，难以获得热力学平衡下的高立体选择性突变体。很多研究致力于通过定向进化、半理性设计等方式改造酶分子，以期提高酶的催化性能。

定向进化是酶分子改造的主要方式，如何从大量突变体中筛选到有益突变体是定向进化的瓶颈，合适的高通量筛选方法将突破这一局限。常见的筛选方法是以β-羟基-α-氨基酸(尤其是苏氨酸) 为底物，在TAs催化下裂解生成甘氨酸和醛，通过偶联醇脱氢酶转化醛生成相应的醇，在此过程中消耗NADH，引起340 nm吸光值的下降，从而衡量TAs的裂解活性[55]。类似的方法有很多，本质上来讲都是以醛为化学探针，筛选裂解活性提升的突变体[56-57]。

Giger等敲除宿主菌E. coli MG1655的丝氨酸羟甲基转移酶glyA、苏氨酸醛缩酶ltaE和2-氨基- 3-丁酮酸裂解酶tdh-knl，构建甘氨酸营养缺陷型宿主，以苏氨酸为底物筛选裂解活性高的TAs，但是该方法未能获得催化效率显著提高的突变体[30]。Bulut等敲除ltaE基因构建宿主菌P. putida KT2440的筛选平台，以DL-threo-苯丝氨酸为唯一碳源筛选高裂解活性的TAs，该方法对D-TA没有效果，只能针对L-TA进行活性筛选[58]。Lee等以过量乙醛为底物，具有较高加成活性的突变体会快速消耗有毒底物，从而被筛选出来，该方法不仅能筛选突变体缩合的活性，亦可筛选底物的耐受性[59]。

通常TAs在羟醛缩合和裂解反应中非对映异构体的比值是不同的，上述方法主要是针对动力学控制下的裂解活性，并未探究热力学控制下的缩合活性和立体选择性。根据定向进化筛选的原则(First law of directed evolution—you get what you screen for)，直接检测所要合成的产物才是筛选的关键。基于此思路，笔者开发了同时检测TAs缩合活性和立体选择性的分步可视化筛选方法[60]。将L-TA和L-threo-苯丝氨酸脱水酶(L-threo-PSDH) 相偶联，通过检测醛底物残余量来推算L-β-羟基-α-氨基酸的总生成量，从而衡量L-TA的缩合活性；反应体系中再加入L-threo-PSDH，特异性催化L-threo产物生成相应酮酸，通过检测酮酸生成量来推算L-threo产物的生成量，进而得知L-erythro产物的生成量，从而衡量L-TA的立体选择性(图 5A)。Purpald和Fe3+检测苯甲醛和苯丙酮酸最佳检测波长分别是540 nm和640 nm (图 5B)，检测上限可达10 mmol/L (图 5C–D)，可实现在热力学控制下可视化检测L-TAs的缩合活性和立体选择性，为高通量筛选TAs提供了一种新颖的普适性方法。

高效构建β-羟基-α-氨基酸的双手性中心一直是TAs研究的难点和热点，很多研究致力于新颖基因挖掘和分子改造来突破酶在热稳定性和立体选择性等方面的瓶颈。

酶的稳定性是衡量其应用价值的重要参数，S. coelicolor来源的L-low-TA在60 ℃处理20 min残余酶活仅有10.6%，随机突变获得H177Y、A169T、D104N和F18I突变体，同样条件处理后其残余酶活分别达到了85.7%、58.6%、62.1%和67.6%[57]。在两个亚基间引入盐桥或二硫键，来提高T. maritime来源的L-low-TA的热稳定性，突变体P56C在80 ℃的热稳定性提高了15%，而突变体W86E对L-苏氨酸的裂解活性有所提高，但是在热稳定性上并没有改变，作者推测来自嗜热菌的该酶可能在热稳定上已经自然进化得较好[61]。

L-threo-4-硝基苯丝氨酸是氯霉素的中间体，以E. coli来源的L-low-TA催化0.5 mol/L甘氨酸和0.1 mol/L 4-硝基苯甲醛在pH 8.0、45 ℃反应24 h，转化率为43%，分离得率为35%，de值约33% (表 2)[62]。甲砜霉素和氟苯尼考是新型氯霉素类的广谱抗菌药，其关键中间体L-threo-4-甲砜基苯丝氨酸(L-threo-MPS) 是酶促合成的重要目标化合物，表 2中第2–5行总结了近年来L-TAs在合成L-threo-MPS中的应用。来源于草状珊瑚状放线菌Actinocorallia herbida的L-low-TA催化合成L-threo-MPS获得了97%的转化率，de值仅有19%。针对产物立体选择性优化反应条件，1 mL反应体系(100 mol/L PBS，pH 7.0) 含有1 mol/L甘氨酸，0.5 mol/L 4-甲砜基苯甲醛，50 mmol/L PLP，12.5 mg/mL湿菌体和30% 乙腈，在30 ℃反应6 h，产物de值提高到61%，转化率为77%[27]。Pseudomonas sp.来源的L-low-TA在1 mL反应中合成L-threo-MPS的de值为53%，但在30 mL制备级反应中de值显著下降到2%[45]。该酶经过随机突变改造和分步可视化筛选，有益突变体V200I在相同体积的制备级反应中合成L-threo-MPS，de值可达71%，显著提升了热力学控制下产物的立体选择性，同时反映出分步可视化筛选方法可有效筛选热力学控制下立体选择性提高的突变体[63]。

将L-threo-MPS和L-erythro-MPS与PLP相结合的配体分别对接到来源于尼氏芽孢杆菌Bacillus nealsonii的L-low-TA的酶活中心，PLP-Gly醛亚胺中间体从si-face亲核进攻可以合成L-threo-MPS，而从re-face进攻可合成L-erythro-MPS。基于此，Zheng等提出增强合成L-threo构型的同时阻断合成L-erythro构型的立体选择性改造策略(图 6)[48]。突变体Y31H提高了L-threo产物的合成，N305R减弱了L-erythro产物的合成，从而提高产物的de值。Y31H/N305R在动力学控制下合成L-threo-MPS，转化率和de值从野生型的53%和30%提高至55%和83%。加入25% N, N-二甲基甲酰胺（N, N-Dimethylformamide，DMF）来提高底物溶解度，转化率提高至87%的同时de值也提升至93% (表 2)，这可能是DMF的加入改变了酶活中心微环境，使得N305R突变位点的刚性增加。

为了提高L-TA的立体选择性，将与底物β-羟基-α-氨基酸的氨基、羧基和羟基等官能团相互作用的氨基酸残基位点进行组合突变，以期通过各个官能团的同时有效绑定，来达到控制立体选择性的目的(图 7)[60]。基于此思路，分子改造来源于Pseudomonas sp.的L-low-TA，突变体D93H/E147D偏好生成L-threo构型产物，其中L-threo-2-氯苯丝氨酸de值可达71%；突变体D93N/E147D催化反转产物构型，L-erythro-苯丝氨酸的de值可达74%，这是首次获得构型反转的突变体(表 2)。分子对接表明，E147突变成位阻较小的Asp，有足够的空间与产物氨基相互作用，达到有效绑定。D93突变成His或Asn，产物苯环分别与H133或者Y312形成π-π堆积作用或CH-π相互作用，缩短产物羟基与H133咪唑的距离，从而使产物偏好L-threo或L-erythro构型产物。突变与产物多个官能团同时相互作用的氨基酸位点，提升或反转产物立体选择性，为TAs的分子改造提供了一种新思路。

L-threo-3, 4-二羟基苯丝氨酸(L-threo-DOPS)，是治疗帕金森氏症的重要药物屈昔多巴，来源于阿维链霉菌Streptomyces avermitilis的L-low-TA在高密度反应器中整细胞催化合成L-threo-DOPS，反应114 h产物浓度达到8 g/L，没有报道de值[22]。随机突变S. coelicolor来源的L-low-TA，经过两轮筛选获得45 000余个突变体，最优突变体Y34C/Y39C/A48T/Y306C催化合成L-threo-DOPS，de值从野生型的14%提高到55%，产物浓度为3.8 g/L[65]。另一个突变体Y34C/ Y39C/Y306C/ R316C在最优化反应(pH 6.5，10 ℃，0.75% TritonX-100) 反应100 h，L-threo- DOPS的de值为60%，产物浓度为4 g/L (表 2)[64]。

一些结构复杂药物的中间体也尝试采用L-TA构建L-β-羟基-α-氨基酸手性砌块。2, 2-二甲基-1, 3-二氧戊环-4-甲醛[66]或2, 2-二甲基-5-乙烯基-[1, 3]-二氧戊环-4-甲醛为醛底物[67-68]，在L-TA催化下合成3, 4-二羟基脯氨酸或多氧菌素的中间体。不对称合成α-氨基-β-羟基-γ-丁内酯[69]，(3R, 5R)-二羟基-L-高脯氨酸[70]也见诸报道。

最近研究发现共表达L-TA与B. subtilis来源的PLP合酶，可显著提高内源性PLP生成量，相比于野生型酶活254.1 U/L，不添加外源PLP的共表达菌株的酶活能提高到1 518.4 U/L，实现PLP的自给自足[14]。

为了克服羟醛缩合反应处在动力学和热力学的限制，将L-TA与来源于粪肠球菌Enterococcus faecalis的L-酪氨酸脱羧酶(L-TyrDC) 相偶联，利用L-TyrDC对L-threo和L-erythro产物之间的活性差异，延长反应时间以实现动态动力学不对称转化合成(R)-2-氨基-1-苯甲醇(图 8A)[71]。偶联来源于谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum的苏氨酸脱氨酶(TD)，将β-羟基-α-氨基酸降解成酮酸，再偶联转氨酶或脱氢酶，进而合成手性α-羟基酸或α-氨基酸(图 8B) [72]。上述多酶级联反应只是利用L-TA构建C-C键，合成的β-羟基-α-氨基酸作为中间产物被后续反应进一步分解，并没有解决L-TA的β-碳立体选择性问题。

与L-TA类似，D-TA催化反应同样受限于动力学和热力学产物达到平衡，不同的是，D-TA在动力学控制下时间较长[12]。根据这一特性，笔者通过降低反应温度和减少酶量等优化方式，减缓羟醛缩合反应速率从而改善来源于代尔夫特菌Delftia sp. 的D-low-TA的β-碳立体选择性，对于特定底物在高转化率下获得高de值，如D-threo-2-氟苯丝氨酸(转化率为92.8%，de值为97.8%)，D-threo-3-硝基苯丝氨酸(转化率为92.2%，de值为93.2%)36]。

D-threo-2-氨基-3-羟基-3-(4-吡啶基)丙酸是药物活性成分β-羟氨基酰胺酒石酸盐的关键中间体，A. xylosoxidans来源的D-low-TA催化4-吡啶甲醛和甘氨酸，一步引入双手性中心的同时，可严格控制产物立体选择性(de > 99%) (图 9)[73-74]。由于反应体系的pH值接近产物等电点，产物以结晶沉淀形式推动反应平衡，提高转化率，极大地简化了分离和纯化。这是目前应用TAs合成β-羟基-α-氨基酸的经典案例[75]。

A. xylosoxidans来源的D-low-TA仅能高效构建特定产物的双手性中心，定向进化改造获得突变体D321C和N101G，对4-甲砜基苯甲醛的活性是野生型的1.5倍和1.3倍，反应6 h转化率能达到36.7%和31.9%，相比野生型提高了13.9%和9.1%，且对苯甲醛、4-氯苯甲醛、4-羟基苯甲醛等活性也有所提高，但未提及产物的构型和de值[56]。

较为苛刻的条件使得D-low-TA在不对称合成中难以广泛应用，更多的是利用其拆分消旋体制备光学纯L-β-羟基-α-氨基酸。A. xylosoxidans来源的D-low-TA的纯酶液可完全拆分0.6 mol/L的DL-threo-DOPS，获得产物L-threo-DOPS的对映体过量(Enantiomeric excess，ee值) > 99%[34]。来源于节杆菌属Arthrobacter sp. 的D-low-TA整细胞催化可完全拆分0.2 mol/L的L-threo-4-甲硫基苯丝氨酸(L-threo-MTPS) 获得接近50%的收率和 > 99%的ee值，副产物4-甲硫基苯甲醛和甘氨酸可回收作为原材料(图 10)[76]。

在动力学拆分中，底物β-羟基-α-氨基酸在水相中溶解性较好，产物芳香醛在有机相中溶解性较好，基于此，为了提高底物浓度并推动平衡反应朝向裂解方向，笔者构建了双相体系下整细胞的拆分反应[36]。50% (V/V) 的1, 2-二氯乙烷做有机溶剂，0.08 g/mL的Delftia sp. 来源的D-low-TA湿菌体，反应9 h可完全拆分1.0 mol/L的DL-threo-苯丝氨酸或0.3 mol/L的DL-threo-MPS，产物ee值> 99%，这是目前底物浓度最高的拆分反应。

Seebeck等获得来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的Geobacillus stearothermophilus的丙氨酸消旋酶突变体Y265A，具有D-TA的羟醛缩合活性，可合成D-β-苯丝氨酸和D-α-甲基-β-苯丝氨酸[77-78]。分子改造获得突变体Y265K/I352W和Y265K/I352W/ M134F，相比于Y265A对D-threo和D-erythro-苯丝氨酸的催化效率分别提高了4.7倍和31.5倍[79]。

光学纯β-羟基-α-氨基酸是非常重要的手性砌块，广泛应用于医药、精细化工品等领域，TAs催化非手性甘氨酸和醛，一步构建双手性中心，在原子经济性和环保方面都有很大优势。已报道的TAs底物谱较广，能催化多种脂肪醛、芳香醛及杂环醛底物，但受限于动力学和热力学的平衡，产物立体选择性普遍较低，不同来源的L-TA合成β-羟基-α-氨基酸均没有获得光学纯产物，D-TA仅可严格控制特定底物立体选择性。已报道多种分子改造酶立体选择性的有益尝试，但产物β-碳的新分子改造策略仍需进一步探索，如基于人工神经网络算法的机器学习指导酶定向进化、酶生物信息学与分子模拟相结合的基因组挖掘以及对特定底物的酶从头设计等。鉴于TAs存在催化性能等不足，可以预期会在酶催化机理、分子改造等方面开展以下几个方面的研究：在自然界中筛选对不同结构特征醛底物具有立体选择性的新颖TAs，开展酶学性质和催化性质研究；解析天然TAs及其具有立体选择性突变体与底物(或底物类似物) 和辅因子PLP结合的共结晶结构，从分子水平理解底物识别和立体选择性控制的催化反应机理；通过分子改造解决TAs催化反应β-碳立体选择性不高的难题，获得可催化不同结构特征醛底物不对称合成β-羟基-α-氨基酸，实现光学纯产物的高效、绿色制备；设计构建新颖多酶级联体系，从廉价的非手性化合物高效合成光学纯β-羟基-α-氨基酸。在此基础上，以催化性能优良的TAs酶及突变体为催化剂，构建绿色生物催化生产工艺，将成为高附加β-羟基-α-氨基酸手性砌块合成的关键技术。