本文转载自"Listenlii",已获授权

之前的引物覆盖度评价系列第5篇(R计算引物覆盖度)，有人留言推荐了这篇文章。是Nature reviews Microbiology近期的一篇综述，综述了研究真菌群落从采样到数据分析的全流程。

IF：31.85

最后一个作者Leho Tedersoo是真菌界的大佬

本文没有生硬的翻译，文章内容也没有面面俱到，只是写了一些我比较感兴趣的内容。对于其余部分我也简单进行记录，有兴趣的读者可以自行阅读原文。

01

 Fungi metabarcoding流程

1

Sample preparation

生物学重复要多。技术上的失败或者序列太少会丢失10%左右的样本。

2

Selectionof markers and primers, and PCR

对一些重要的植物病原体和内生菌，ITS区域到达种水平的分辨率不够，但是目前也没有替代的markers。

很多大尺度的微生物组计划使用ITS1区域引物(ITS1F and ITS2)，但是真菌中会含有内含子，从而造成很多的偏差。

ITS2的优势是长度变化小，更多的通用引物位点。导致了分类学水平上的bias比ITS1区小。作者推荐扩增ITS2或者全长ITS区域，前引物 gITS7ngs 或 ITS9MUNngs，后引物 ITS4ngs。

引物前段的barcode应该大于6个碱基，并且不同barcode至少存在3个碱基不同（PacBio中是4个）。

需要使用高保真的有校正功能的聚合酶，来减少随机错误及嵌合体的形成。

三代测序优劣：扩增长度更长，物种分辨率更好，减少了对死亡微生物的扩增。但是一个缺点是对低质量材料效果不好，如遗留的植物标本，DNA已经降解了，全长ITSDNA序列已经不能得到。

不同区域引物汇总

Box1介绍二代和三代高通量测序平台，包括

454(Roche)，

IonTorrent PGM and GeneStudio (Thermo FisherScientific)，

Illumina MiSeq, HiSeq and NovaSeq，

PacBio RSII and Sequel (Pacific Biosciences)，

Oxford Nanopore MinION,GridION and PrometION (Oxford Nanopore Technologies)

Illumina：

At present, MiSeq Illuminasequencing is the default choice for metabarcoding studies of fungi and otherorganisms, and the paired-end approach covers amplicons of up to ~550 bases inlength (MiSeq 2×300). It is also the principal platform for conducting metagenomicand metatranscriptomic analyses on the basis of fragmented DNA or complementaryDNA.

Box2检测代谢上具有活性的真菌。最近一项研究表明死去而残留的DNA可占ITS序列的40%。尤其是死去树木中的内生菌，DNA可在真菌分解后存在数年之久。作者介绍了通过RNA鉴定活性真菌的测序方法。

Fungi metabarcoding 策略

3

Controls and technical replication

需要设置阴性（无样本）和阳性对照（在样本中不存在的已知物种）及Mock community （such as SynMock）。

4

Quality-filtering of HTS data

推荐paired sequences forshort fragments such as ITS1 or ITS2。

推荐ITSx去掉非目标区域。

USEARCH和VSEARCH 检验嵌合体效果很好。

5

Sequence clustering and operational taxonomic units

权衡种水平的分辨率及测序错误，ITS聚类为OTU阈值一般为 97.0–98.5%。

对于ITS, single-linkage clustering methods优于complete-linkage clustering。

single-linkage：新的序列的相似度只要满足之前OTU中的一个序列即可被划分到那个OTU中。这种情况OTU的高估更少。另外，single-linkage不依赖于seed序列。即不管哪个序列先被定义为一个OTU，总的OTU变化不大。

complete-linkage：新的序列必须和之前OTU中所有序列相似度都满足条件才会被划分进去。

作者认为DADA2基于序列的变异，考虑到基因组中可能存在多个不同的拷贝，可能不适用于ITS区域。（拷贝之间的差异会把一个物种分成几个OTU？其他如Unoise, deblur呢）

Box3高通量测序过程中的bias：

Marker误差：

Markers 在长度、扩增效率、物种分辨率、拷贝数、可对准性(alignability)上存在差别。由于真菌rRNA拷贝数差异很大，对于多拷贝的物种bias更大。

引物误差：

3’错配带来PCR误差很大。

PCR误差：

短序列优先扩增，因此marker应该避免含有内含子(introns)；

使用高保真、具有校正功能的聚合酶

其余还有样本提取误差、建立文库误差、测序误差、生信分析误差、建库中Index的交叉污染、clustering算法带来的误差、不同测序深度带的的误差等。

6

Sequence-based taxonomic identification and taxon communication

最常用的是BLAST。对于SSU和LSU，作者分别推荐SILVA SSU Ref NR 和RDP 数据库。

通过SSU区域研究丛植菌根真菌建议使用Maarja-AM。

近期三个较新的数据库：International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC)；UNITE and Warcup ITS。作者推荐UNITE。

推荐在INSDC or UNITE中对OTU进行注释。

物种划分标准： ≥97.0–98.5%相似度为种, ≥90%为属, ≥85%为科, ≥80%为目, ≥75% 为纲，≥70% 为门。

推荐FunGuild预测真菌功能类型 (guilds)。

7

Data processing andanalysis pipelines

常用mothur, USEARCH and QIIME。

对于Illumina数据，推荐PipeCraft, LotuSand PIPITS及 Amplicon toolkit (AMPtk)。

对于PacBio数据，推荐PipeCraft。DADA2也可以。

对于PIPITS，我之前介绍过。详见 PIPITS: 分析Illumina测序ITS数据的工具

02

新兴的技术与方法 (略)

1. Quantification.

2. Arrays and microarrays.

Geochip

3. Metagenomics andmetatranscriptomics.

4. HTS methods for identificationof strains and individuals.

03

已有的一些二代和三代测序成果 (略)

1. Overall fungaldiversity. 全球真菌多样性

2. Saprotrophic fungi. 污水营养的真菌

3. Mycorrhizal fungi. 菌根真菌

4. Plant-pathogenicfungi. 植物致病菌

5. Foliar endophytes 叶内生菌

6. Aquatic fungi.水生真菌

7. Human-associatedfungi. 人类相关真菌

04

Perspectives and conclusions

展望中提到的一点比较有感触。目前往往用于真菌的引物也可以扩增出其他很多真核生物。且引物对于真菌和其他真核的区分度并不是很好。虽然扩的是真菌，ITSx仍可以鉴定出很多真核生物，如后生动物、藻类及维管植物等。这虽然给只研究真菌带来了困难，但是反过来，为什么要只研究真菌呢？既然和其他生物无论在共存上还是在序列上相关性都那么强，一起研究未尝不是更优的选择。

Similarly, there may be littlereason to target individual fungal guilds such as ectomycorrhizal fungi inisolation when we now know that fungi interact across taxonomic groups andfunctional guilds, although the details of these interactions are still poorlyunderstood.

Finally, it may be misguided tosequence only fungi; it would be better to consider including other eukaryotesand prokaryotes, given that subsets of these groups often co-occur and interact.

文章最后也总结道，真菌只对真菌学家重要，这一个普遍的观点已经阻碍真菌学发展太久了。

Failure to do so will serve to maintainthe all-too-common view thatfungi matter only to mycologists, a belief that has hauntedmycology for far too long.

Reference

Nilsson, R. H., S. Anslan, M.Bahram, C. Wurzbacher, P. Baldrian and L. Tedersoo (2018). "Mycobiomediversity: high-throughput sequencing and identification of fungi." NatRev Microbiol.

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