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作者：

刘存成

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摘要：

现阶段,环境中典型新型污染物的地球化学循环受到越来越多的重视.尤其是抗生素污染迁移及治理过程,抗生素污染可导致抗生素耐药菌和抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)的出现,严重威胁人类健康和环境安全.另一方面,抗生素生产过程中,还会产生富含营养并残留大量有毒有害物质的抗生素菌渣.抗生素菌渣是一种危险有机废弃物,其安全有效的处理一直是制药企业的难点.随着环境问题的日益突出,抗生素污染的防治显得尤为重要,如生物降解和转化是抗生素污染治理的主要手段.与传统微生物修复相比,黑水虻幼虫(Black Soldier Fly Larvae,Hermetia illucens)可高效无害化转化大多数有机废弃物,且具有修复效率高,生态足迹小和扩散风险低等独特优势.另外,昆虫肠道中发生的许多代谢反应是由其肠道微生物群的元基因组编码的,而不是由其自身的基因组编码的.因此,开展黑水虻幼虫降解抗生素,转化抗生素菌渣的肠道微生物机制研究,可为环境中抗生素污染的高效治理及环境修复提供重要的理论支撑.为考查黑水虻幼虫降解抗生素,消化木质纤维素,转化处置抗生素菌渣的能力及效果,实验选取土霉素(Oxytetracycline,OTC),水稻秸秆,土霉素菌渣(Oxytetracycline Bacterial Residue,OBR)为降解研究对象,采用细菌16S r RNA高通量测序,高通量定量PCR(High-Throughput quantitative PCR,HT-q PCR)等新兴分子生物学技术,分析了黑水虻幼虫降解OTC,消化水稻秸秆及转化OBR过程中黑水虻幼虫肠道微生物生态特性;结合OTC降解的过程,阐述了黑水虻幼虫强化OTC降解的动力学过程及其肠道微生物生态机制.主要研究结论如下:(1)考查了黑水虻幼虫降解OTC的过程及效率,分析了其肠道微生物群落变化及ARGs的表达.结果表明:OTC未明显影响黑水虻幼虫的生长发育,且未在幼虫组织中检测到OTC残留.当基质中OTC初始浓度为100(HU),1000(TH),2000(TT)mg·kg~(-1)时,黑水虻幼虫降解OTC的效率分别为82.7%,77.6%和69.3%,远远大于对照组的22.64%,23.19%和19.34%.尽管基质中OTC影响了幼虫肠道微生物群落结构及组成,但黑水虻幼虫肠道微生物可根据变化的环境进行自我调节与适应,其中Enterococcus,Ignatzschineria,Providencia,Morganella,Paenalcaligene和Actinomyces对OTC的胁迫响应明显.黑水虻幼虫肠道内发现了大量的ARGs(180 ARGs和10 MGEs(Mobile Genetic Elements)),且与整合酶基因和转座酶基因显著正相关;尤其四环素类抗性基因(TRGs,Tetracycline Resistance Genes)丰度最高,占总ARGs的67%.相关性分析表明:Enterococcus,,Ignatzschineria,Bordetella,Providencia和Proteus均为四环素酶修饰基因的潜在宿主,可能是降解OTC的主要功能菌.(2)考查了黑水虻幼虫消化水稻秸秆的能力,分析了黑水虻幼虫肠道微生物群落结构,组成及其功能.结果表明:黑水虻幼虫主要消化降解纤维素和半纤维素,且碱性过氧化氢预处理可有效增强黑水虻幼虫消化降解秸秆的能力,尤其纤维素的消化率由58.2%显著提高到70.9%(P0.001);最终,对照组和预处理组木质纤维素的有效转化率分别为10.7%和11.4%.不同的木质纤维素底物基质影响了黑水虻幼虫肠道微生物群落结构和组成,消化未进行预处理的秸秆时,其幼虫肠道微生物优势菌属为:Miniimonas,Dysgonomonas,Paenibacillus,Devosia,Citrobacter和Morganella;而消化采用碱性过氧化氢预处理的秸秆时,其幼虫肠道微生物优势菌属为:Actinomyces,Dysgonomonas,Devosia和Pelagibacterium.且代谢,环境信息处理和遗传信息处理是黑水虻幼虫肠道微生物主要功能.(3)在黑水虻幼虫降解OTC,消化木质纤维素的基础之上,考查分析了黑水虻幼虫转化OBR过程中的肠道微生物生态特性;实验研究以OBR和豆粕混合物为黑水虻转化降解基质,即OBR:豆粕(干重质量比)为0:1(CK),1:20(TW),1:2(TD)的基质.结果表明:黑水虻幼虫对OTC的最高耐受度可能在3042～4653mg·kg~(-1)(干重);底物基质的不同显著影响了黑水虻幼虫生长发育(P0.001);但未在黑水虻幼虫组织中检测到OTC残留.转化结束,CK,TW和TD组基质消化率分别为70.83%,59.30%和54.54%;TW和TD组中OTC的降解效率分别为65.85%和63.28%,远远大于对照组情况下的17.44%和11.02%.黑水虻幼虫肠道微生物群落结构和组成因底物基质的不同存在显著差异(P0.05);Enterococcus,Ignatzschineria,Providencia,Morganella,Paenalcaligenes和Proteus可能是黑水虻幼虫转化降解OBR的优势菌属.在黑水虻幼虫肠道中检测到丰富多样的ARGs(153 ARGs和10 MGEs),且与整合酶基因和转座酶基因显著正相关;与CK组相比,TW和TD组TRGs的比例明显增加.黑水虻幼虫转化降解OBR过程中,其主要的肠道微生物功能为代谢,环境信息处理和遗传信息处理,确保黑水虻幼虫可有效转化OBR并降解OTC.(4)一级动力学模型很好的描述了OTC降解的动力学过程;并对比分析了黑水虻幼虫粗蛋白,粗油脂,及油脂脂肪酸组成.与对照组(无黑水虻幼虫转化降解)相比,黑水虻幼虫显著强化了OTC降解的动力学过程(P0.01),即OTC的降解半衰期显著缩短4.74～7.86倍,降解效率显著增加3.34～5.74倍.实验中,底物基质未明显影响黑水虻幼虫粗蛋白(43.22%～45.74%)和粗油脂(15.26%～24.44%)含量,但高浓度OTC胁迫导致粗油脂中饱和脂肪酸的相对含量增加.黑水虻幼虫肠道中共检测到27个TRGs,并包括所有四环素类抗性机制,即核糖体保护机制,外排泵机制和酶修饰机制;黑水虻幼虫肠道中TRGs保证黑水虻幼虫可耐受高浓度OTC,并可强化降解OTC,转化利用OBR.因此,与传统微生物降解抗生素相比,黑水虻幼虫降解抗生素,修复抗生素污染具有更高效,更安全等特殊意义.当前,环境中抗生素污染治理受到越来越多的关注,但通过生物,特别是昆虫,治理修复抗生素污染的研究相对较少,尤其是基础研究更为鲜见.基于黑水虻幼虫肠道微生物功能及其生物学特性,黑水虻幼虫是研究微生物与昆虫协同降解治理典型新型有机污染物的良好模型,在基础研究和人类环境健康需求方面都具有重要的意义.本课题将基础研究与实际环境健康需求相结合,对于深入认识黑水虻幼虫降解抗生素的行为及其作用机制具有重要的科学意义;可为抗生素等典型新型环境污染物降解治理提供科学依据;黑水虻幼虫降解抗生素系统模式的建设,可为环境中有毒有害物质的降解转化奠定理论基础,为高效,资源化,无害化处理抗生素菌渣及工农业废弃物提供新的思路.

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