我的研究课题主要是用慢病毒敲低神经干细胞中的某段基因，所以这一期先来了解一下如何构建下调基因（shRNA）吧！

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

慢病毒载体系统由慢病毒载体系列、psPAX2 载体和 pMD2G 载体三质粒组成。 慢病毒载体中含有病毒的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅助元件及目的基因或者 shRNA 序列。psPAX2 载体含有 gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol 基因，编码病毒特异性的酶；rev 基因，编码调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子。pMD2G 载体中含有vsvg 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。通过转染试剂将上述三质粒共转染到包装细胞293T 中，转录出的目的基因 RNA与psPAX2、pMD2G 基因翻译出的蛋白可组装成为慢病毒。

基因沉默原理 

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是与靶基因序列同源的双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）所诱导的一种特异性基因沉默现象。使用 RNAi 技术可以特异性降低或关闭特定基因的表达，故该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。细胞内转录的 shRNA 被加工后掺入 RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶 RNA。病毒 shRNA 载体也可用于 RNAi 干扰，其带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。相较于其它载体，病毒 shRNA 载体可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，转染效果稳定，且可避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。

第一步、慢病毒载体的制备

一、实验流程

二、实验材料

1. 主要实验试剂

试剂名称                                        生产厂家                                         货号 

vector                                         Hanbio Biotechnology 

DH5α                                     competent cell TIANGEN                 CB101-02 

phanta Max-Super-Fidlity DNA 

polymerase                                   Vazyme                                       P505-D1 

HB-infusionTM                 Hanbio Biotechnology 

Plasmid DNA purification     MACHEREY-NAGEL     740412 

Gel DNA purification                 Generay                                         GK2041 

DNA ladder                                Generay 

Restriction Endonuclease         Thermo Scientific

2. 主要实验仪器

试剂名称                 生产厂家                 货号 

PCR 仪                     BIO-Rad                 T100 

PCR 仪-384 孔         上海启步         WSB-2P-384 

离心机                         湘仪                    TGL-16 

37℃ 恒温培养箱         精宏                 GNP 9050 

恒温水浴锅                 一恒                     HSWS26 

超净工作台                 苏净                     SW-CJ-1B 

微量移液枪         Thermo Scientific 

紫外成像仪                 天能                     Tanon 1200 

核酸电泳仪                 天能                     EPS 300 

水平电泳槽                 天能                        HE-120

三、分子克隆实验步骤

1. 载体及目的基因信息

2. 干扰靶点设计和引物合成

这部分就根据你的目的基因序列，设计siRNA 序列和 shRNA 序列，我的是公司设计的。

3. 引物退火形成带粘性末端的双链片段（就是PCR）

体系

试剂           体积（uL） 

10 *oligo Buffer： 2 ul

Primer F： 1 ul

Primer R： 1 ul

H2O ：16ul 

total： 20ul

退火程序

95°C 10min 

75°C 10min 

55°C 10min 

35°C 10min 

15°C 10min

4. 载体酶切

根据如下表中顺序依次加入每种试剂，轻轻吸打混匀，置于 37℃水浴锅中反应 1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段； 载体酶切体系如下： 

试剂   体积(μL) 

载体 DNA(1ug/uL) 1 ul

10*buffer 4ul 

DdH2O 32 ul

限制性内切酶 1 1.5 ul

限制性内切酶 2 1.5ul 

total 40 ul

注：限制性内切酶的使用量以及酶切的时间可根据酶活性进行调整；若是单酶切，则进行相应体系的调整。

5. 干扰片段与载体连接

连接反应体系（20uL）如下：

试剂       体积(μL) 

退火产物  4 ul

酶切好的载体 X(≥50ng) 

T4 ligase buffer 2ul 

T4 ligase 1ul 

H2O 13-X ul

total 20ul 

以上连接液在 22℃连接 1-2h，或者 16℃连接过夜。

6. 转化

1）DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，要立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏； 

2）待感受态融化后，以每管 50 μL 的体积分装（对于质粒转化，20 μL 就足够了），分装之后以不超过感受态体积 1/10 的量加入连接产物（目前加 5 μL 连接产物），冰上放置 20-30min； 

3）42℃热激 90 s（这个时间要非常严格），热激完之后立刻插入冰上冰育 2-3 min； 在超净台中，加入 500μL LB 培养基（注意一定是无抗的 LB 培养基），轻柔的上下颠倒 3-5 次；

5）37℃、230rpm 震荡培养 45-60 min； 

6）将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板子倒放37℃恒温箱培养12-16h；

7. 菌液 PCR 鉴定

菌液 PCR 鉴定体系： 

组分名称   体积（μL） 

2xHieff PCR Master MIX (Dye) 5 μL

引物 1 0.5μL 

引物 2 0.5 μL

菌液 2μL 

ddH2O 2μL 

总体积 10μL 

注：配置 mix 时，mix 中的比例应同等比例放大。待验证的克隆数；根据使用的载体，选取 

验证引物 

菌液 PCR 鉴定程序 

循环步骤 温度 时间               循环数 

预变性 94°C 5 min                1 

变性 94°C 30 sec 

退火 56°C 30 sec 

延伸 72°C 30~60 sec/kb     25

彻底延伸 72°C 10 min         1 

保存 12°C 0                          1

8. 测序

如果测序结果与目的序列一致，则该目的质粒构建成功。

四、质粒抽提

测序成功之后进行菌液扩增，质粒抽提纯化，质粒抽提的方案按照抽提试剂盒的说明书为准。抽提的质粒经 QC 验证合格之后用于转染细胞。 

备注：质粒 QC 的原则是浓度大于 200ng/uL，260-280 在 1.8-2.0 之间

第二部分 慢病毒包装与质量检测

一、 实验流程

二、 实验材料及仪器

1. 细胞株和菌株

包装细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM（含 10 % FBS）。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 

菌株：大肠杆菌菌株 DH5-α，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

2. 慢病毒包装系统

三质粒系统，pSPAX2、pMD2G 和穿梭质粒（携带目的基因或者 shRNA）。

3. 实验试剂

试剂名称 生产厂家 产品货号 

胎牛血清 Thermo 26050070 

大肠杆菌菌株 DH5α Tiangen CB101-03 

胰蛋白酶 Thermo LP0042 

质粒 DNA 小,大量抽提试剂盒 Tiangen DP117 

DMEM Thermo 11965118 

LipofiterTM Hanbio Biotechnology HB-TRCF-1000 

PBS Thermo 10010001

4. 实验仪器

仪器名称 型号 厂家 

细胞培养箱 3111 Thermo 

生物安全柜 DELTA A2 Labconco 

高速冷冻离心机 ST40 R Thermo 

倒置生物显微镜 CKX53 奥林巴斯 

超速冷冻离心机 CP-100WX 日立

三、慢病毒包装及浓缩纯化

3.1 提前传代 293T 细胞用于转染（前提是细胞已经培养到可以满足后续转染实验需要）。 操作完毕后置于 37°C，5 % CO2 的培养箱中； 

3.2 转染前观察细胞密度，达到 70~80 % 的汇合率即可进行转染； 

3.3 做脂转 complex，转染 100mm 皿的 complex 成分如下： 

注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipofiterTM说明书。 

脂转 complex 混匀后在室温下温育 15 min 后缓慢滴加至 293T 细胞中，于 37℃、5% CO2 细胞培养箱中培养； 

3.4 转染后 16h 更换含 10 % 胎牛血清 FBS 的新鲜完全培养基； 

3.5 收毒：转染后 48 h 和 72 h 分别收集两次病毒上清（48 h 收集后置换新鲜完全培养基）。 在 48 h 收毒时，将 100 mm dish 中的培养基倒入 50 mL 离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入 10 mL 含 10 % 胎牛血清 FBS 的新鲜完全培养基，平稳置于 37°C，5 % CO2 的恒温培养箱中继续培养。在 72 h 收毒时，直接将 100 mm dish 中的培养基倒入 50 mL 离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染； 

3.6 超速离心：将 50 mL 离心管中的病毒上清，4°C ，2000 × g ，离心 10 min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4°C ，82700 × g ，离心 120 min，完全培养基重悬病毒沉淀，最后将超离重悬液分装到灭菌处理的病毒管中。 

3.7 病毒保存：按照要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日），-80°C 冰箱保存。

四、慢病毒质量检测

1. 无菌检测

检测方法：取 10uL 病毒加入 96 孔板的 Hela 细胞进行验证，培养 24h 后显微镜镜检： QC 标准：培养基需澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，无任何细菌及真菌污染。

2. 支原体检测

检测方法：取 10uL 病毒，96℃水浴 15min 后于超净台中配置 PCR 反应体系。PCR 反应后电泳确定是否含有支原体污染。 QC 标准：PCR 胶图无明显条带

3. 滴度检测

滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。“TU”为“transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。IU/mL， 指每毫升中含有的整合活性的病毒颗粒数。“IU”为 integration units 的缩写，中文为整合单位。

I. 细胞准备 

将生长状态良好的 293T 细胞消化计数后稀释至 1x105/mL, 加入 96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备 6 个孔。放入 37°C ，5 % CO2 培养箱中培养。 

II. 加病毒 

第二天，准备 6 个 1.5 mL EP 管，第一个 EP 管中加入 10 μL 病毒液，然后做 3 倍梯度稀释，共 6 个稀释度。 

III. 追加培养液 

第三天，有需要加 puromycin 筛选的孔，先吸去 100 mL 含病毒培养基，加入 100 μL 含 1.5 μg/mL puromycin 的 10 % FBS 完全培养基。 

IV. 观察结果并计算滴度 

第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前 6 h 需更换新鲜 10 % FBS 完全培养基，从孔中吸出 80 μL 培养基，然后加入 80 μL 新鲜 10 % FBS 完全培养基，放入 37°C ，5 % CO2培养箱中培养。6 h 后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在 10~50 % 的孔计算病毒滴度。 滴度（TU/mL）= 细胞数×阳性克隆百分比×MOI（1）×病毒稀释倍数×103 TU/mL

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