本文所述灵芝(Ganoderma lucidum)是指隶属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermataceae)寄生于腐木中的灵芝属(Ganoderma)[1]真菌。灵芝具有独特的疗效，在我国被用作名贵中药材已有1 000多年。《本草纲目》中记载“灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙”。现代药理学研究证实，灵芝含有灵芝多糖、灵芝三萜类化合物、甾醇等多种生物活性成分，具有调节免疫[2]、抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、抗衰老[5]、保肝护肝、治疗心脑血管疾病[6]等药理作用。

野生灵芝由于生长环境要求苛刻，造成产量严重不足。因此，人工栽培便成为灵芝增产的一条途径，其在一定程度上提高了灵芝的产量[7]。人工栽培虽能扩大生产规模，但存在产量不稳定、品质参差不齐、生产周期长、劳动强度大、占地面积广、受气候影响等问题，其中生产周期长与成本高是主要问题。可见，开发生产周期短、产量高、品质稳定且能工业化生产的技术途径显得尤为重要。研究表明，通过液体深层发酵生产的灵芝菌丝体，不但苦味淡，而且灵芝多糖等主要有效成分不低于甚至有些指标还高于子实体；不同灵芝的菌丝体所含蛋白、脂肪、糖和灰分等主要营养成分均比子实体高(表 1)；同时也有研究表明，菌丝体的生物活性成分易于分离利用，人体对其吸收的效果比子实体和孢子粉要好，而且粗纤维比子实体少，可以直接食用或用于食品加工[8-11]。近年来，灵芝菌丝体液体发酵技术的开发与应用取得了较大进展。本文主要从灵芝液体发酵产物(菌丝体与发酵液)的生物活性成分及其药用效果、液体发酵培养工艺及其开发应用等方面的进展进行综述，并对其中存在的问题加以分析讨论，以期为灵芝液体发酵的深入研究和广泛应用提供参考。

利用液体深层发酵生产灵芝菌丝体的技术途径具有生产周期短、产量高、产品质量稳定、不受季节影响等优点，并可实现工业化生产。液体发酵技术改变了人工栽培生产周期长与成本高的生产现状，极大地提高了生产效率。目前已知可用于人工栽培的灵芝品种多达250种，国内常见的有赤芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和黑芝(G. atrum)等种类，而在液体发酵领域常用到的灵芝菌株见表 2。

传统的灵芝产品主要是子实体、孢子粉和孢子油。子实体纤维化、木质化程度高，味苦，一般不直接食用，而是辅以熬制入药；孢子粉细胞壁厚，不易被人体利用，不太适宜直接食用，一般对其进行破壁处理后泡水饮用；孢子油成本高，价格昂贵，应用范围窄。相对于传统野生型灵芝与人工栽培灵芝而言，灵芝真菌的液体发酵具有非常大的优势。由于液体发酵技术的优势所在，在发酵的过程中可有效地人为控制，使得发酵向着所需方向进行。

液体发酵技术的主要优势在于生产周期短、成本低、产量高。相对于传统的仿野生型灵芝生长环境的人工栽培技术而言，使用液体发酵技术可大大提高灵芝真菌某种活性物质的产量，从而定向富集目的产物(表 3)。目前，关于灵芝液体发酵富集的目的产物主要集中于某类化合物的大类上。

已有的研究表明，从灵芝中可分离出的活性成分多达400余种，主要分为多糖、三萜、蛋白、生物碱、甾醇等[26]，这些活性物质具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老及降血糖血脂等功效[27]。灵芝液体发酵产物(菌丝体和发酵液)不但能产生灵芝的主要活性成分，而且具有连续大量生产、周期短、易于干预控制等优点，便于灵芝活性成分的大规模制备和工业化生产[28-29] (表 4)。

尽管菌丝体与发酵液的活性成分不尽相同，但两者有着相同或相似的药用效果(表 4)，现主要对灵芝液体发酵产物(菌丝体和发酵液)的药用效果进行归纳总结。因为具体活性成分的药理作用与子实体的基本一致，在此不赘述。

灵芝三萜类作为灵芝的主要活性成分之一，存在于菌丝体及发酵液中，具有多种药用效果，其中抗肿瘤效果尤为显著。从灵芝菌丝体中分离得到的4个三萜类化合物能抑制肿瘤细胞L1210及K562的增殖[46]；Sun等[47]发现菌丝体多糖是一种典型多糖，并且具有较好的抗肿瘤活性；同时，研究发现松杉灵芝(G. tsugae)发酵产物对H22肝腹水瘤细胞的增殖具有抑制作用[48]。

灵芝三萜类化合物对不同类型肿瘤有着同样的抑制效果，后续可利用灵芝发酵产物开发有关的抗肿瘤药物。

最近有研究报道发现，灵芝液体发酵产物可提高断奶仔猪对猪圆环病毒-2的免疫力并促进其生长[49]；类似的研究发现肉鸡在喂食灵芝液体发酵物后，其免疫功能、生产性能和抗氧化性能均得到显著提高[50]。可见，灵芝发酵产物在提高动物机体免疫力上有着良好的效应。

尽管目前灵芝发酵产物在增强免疫力上的临床研究大部分体现于家禽牲畜，但其效果已非常显著，相信其在灵长类动物中可能也具有较好的效果，但需要进一步的研究验证。

现已发现，从发酵液中提取得到的灵芝多糖具有抗氧化作用，而且抗氧化活性已被证实[51]，对于其抗氧化能力强弱的问题，有研究表明灵芝多糖的抗氧化能力与其分子量的大小和浓度成正相关。Kan等[52]研究了不同分子量灵芝多糖的抗氧化作用，发现分子量最大的GLP80的抗氧化效果最佳，而分子量最小的GLP40的效果最差。此外，不同品种灵芝的抗氧化能力不同，与发酵产物中黄酮、多糖、三萜和多酚的含量有关[53]。根据这一特性，后续可利用发酵产物开发相关的美白抗衰产品。

真菌是天然抗生素最丰富的来源之一，灵芝属于多孔真菌，其液体发酵产物中含有抑制微生物生长的活性物质[54]。研究发现，灵芝活性成分可抑制多达15种细菌的生长与繁殖[55]，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，常见的如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌[56]，罕见的有幽门螺旋杆菌[57]；而在抗病毒方面，已有研究发现提取的灵芝酸能阻止一些特殊病毒的侵蚀作用，如EV71病毒[58]。最近有报道[59]称从灵芝菌丝体中提取的有效抗菌物质可能是一些以前未知的次级代谢产物，这为灵芝液体发酵生产抗菌物质提供了新的思路。

近年来，糖尿病的患病率与发病率逐年升高，而血糖水平过高是糖尿病患者的主要特征。已有研究表明，灵芝发酵产物具有降低血糖[60]和血脂[61]水平的作用，从灵芝发酵产物中提取到的灵芝多糖可有效降低处于妊娠期的患有糖尿病大鼠的血糖水平[62]，灵芝菌丝体多糖(Polysaccharides of Ganoderma lucidum strain S3，GLPS3)对慢性胰腺炎有较好的疗效，可降低慢性胰腺炎发展为糖尿病的几率[63]，灵芝真菌液体发酵产物在降血糖和血脂方面具有潜在的应用价值。

液体发酵是一种将菌丝体生长所必需的营养制成液体培养基，再进行摇瓶发酵或发酵罐发酵以达到扩大化培养菌丝球的技术。摇瓶发酵和发酵罐发酵的区别在于其发酵规模与用途，前者主要用于菌种选育与工艺分析研究，后者则主要用于工业化生产。灵芝真菌液体发酵可产生大量的菌丝体，其产生的生物活性物质的含量和种类与天然采集的灵芝子实体的基本一致，甚至某些重要活性物质的含量还高于子实体[10]。相较于传统栽培，液体发酵技术具有生产周期短、成本低、产量大、产品质量稳定且能自动化工业生产等特点，正在成为灵芝培养的新模式，同时也成为关于灵芝属真菌生产利用研究的热点。

灵芝真菌液体摇瓶发酵的探索主要集中于发酵培养基条件的筛选与优化以及生产菌种的选育上，通过初步的摇瓶发酵实验可筛选出高产目的产物的菌株及其最优培养条件。近来有报道称在灵芝真菌液体发酵过程中使用超声波处理后可促进灵芝菌丝体的生长和代谢[64]；武梅等[65]对灵芝摇瓶发酵培养产灵芝多糖的过程进行了动态研究，通过研究发酵过程中pH、总糖、还原糖等的变化，初步优化确定了高产灵芝多糖的摇瓶培养条件。然而针对培养基最适碳源的选择，Cui等[66]发现来源丰富、价格低廉的麦芽汁可取代常用的葡萄糖作为唯一碳源。

通过摇瓶发酵培养筛选，研究者选育出在最优发酵工艺下能高产某种生物活性代谢产物(如漆酶、灵芝多糖、灵芝三萜等)的菌株[67-71]，为灵芝发酵工业化生产提供了多元化选择。

小试、中试发酵生产主要是探索经摇瓶发酵优化后的培养基及发酵条件的可行性，为进一步开展大型发酵罐工业化生产提供发酵工艺与试验数据的支持。灵芝菌丝体中含有丰富的三萜、甾醇等活性物质，有研究报道灵芝新菌株G0017菌丝体在一种有效的三萜和甾醇发酵生产多级曝气速率控制工艺下的产率比固定曝气速率每体积液体每分钟1.50体积空气量提高了69.54%和75.63%，并在3 L和50 L发酵罐中得到验证[23]。王艳对灵芝小试发酵生产多糖的工艺条件进行研究，优化出一个最佳液体培养基配方，为扩大规模生产提供了参考依据[72]。陈琼华等以韦伯灵芝(G. weberianum) TZC-1作为生产菌株，在确定摇瓶发酵培养[73]及5 L小型发酵罐最优生产工艺的基础上进行中试发酵产漆酶的工艺优化，结果显示在最优的中试放大发酵工艺下获得的漆酶活力是摇瓶发酵水平的2.5倍[74]。Wei等[75]对筛选出的一株高产多糖与灵芝酸的灵芝菌株进行发酵，在摇瓶发酵培养条件下确定最优的培养基组成，并在10 L的生物反应器中得到了验证，同时进一步扩大中试发酵培养，使得生物量、多糖、灵芝酸等产量均得到提高。

近年来，采用液体发酵技术来获取灵芝中的有效成分受到了人们的广泛关注，并且也逐渐成为目前国内外工业化应用的重要手段之一。Lee等[76]在气升式发酵罐中引入双阶段pH控制技术生产灵芝多糖，发现在菌丝体生长对数初期将pH值从3.0调节到6.0，可改善菌丝的生长与多糖的产量；Tang等[77]在搅拌型生物反应器发酵生产灵芝多糖与灵芝酸的过程中通过控制溶解氧含量与分批补料的方式逐渐提高发酵液含量，提高了多糖与灵芝酸的产量。已有的研究成果均表明，灵芝真菌液体发酵的工业化是具有可行性与可实践性。截至目前已经开发出多个灵芝液体深层发酵工业产品，如“灵芝酸枣仁胶囊” (浙江方格药业有限公司)、“中祥灵芝菌丝体胶囊” (上海中祥生物制品有限公司)、灵芝银耳保健口服液[78]和灵芝酸奶[79]等。

通过液体发酵获得灵芝菌丝体的时间远少于传统栽培获得灵芝子实体的时间，从液体发酵产物中提取主要活性成分的过程相较于子实体也简单容易得多。目前越来越多的研究者更倾向于开发以灵芝液体发酵菌丝体和发酵液作为原料的产品。

灵芝真菌在液体发酵的过程中自身会代谢分泌某些活性物质，这些活性物质存在于发酵液中。因此可间接使用灵芝发酵液生产饮料与保健酒，如：以牛蒡为培养基，加入灵芝、杏鲍菇进行混合液体发酵，再取发酵液加入各种配料调制成营养、美味的复合保健茶饮料[80]；张帅等[81]向灵芝发酵液中加入糯米与酒曲，通过再发酵制备了一种香气浓郁的灵芝糯米酒；邓功成等[82]优化确定了一种凝固型灵芝酸乳发酵工艺条件：灵芝菌液(含菌丝体) 25%，鲜牛乳75%，蔗糖8%，接种量5%，42 ℃下发酵2 h，直接可获得凝固型灵芝酸乳特色食品；黄清铧等[83]研制出一种以甘蔗汁进行灵芝液体发酵的功能性饮料，并对饮料配方进行了优化。

利用液体深层发酵产物开发灵芝相关的功能性食品具有广阔的发展前景。早在20世纪60年代，美国、英国和法国等[84]就已经开始通过液体发酵大规模生产灵芝菌丝体来制作调味品；而将发酵后的菌丝体经过干燥粉碎后加入面粉、木薯淀粉，可生产出具有保健功能的膳食方便食品[85]。灵芝发酵获得的菌丝体具有很大的应用价值，后续可将菌丝体用作辅料添加到食品中制作成各种具有保健和营养功能的食品，如添加到饼干中[86]。

灵芝液体发酵获得的菌丝体，其呈球状并附有星射状的菌丝形态，使得其具有一定的吸附性。根据灵芝菌丝体这一特点，Mohd Hanafiah等[87]研究发现塞尔维亚野生灵芝(wild-Serbian Ganoderma)菌丝体可有效清除合成污水中的污染物；Torres-Farradá等[16]发现韦伯灵芝(G. weberianum) B-18菌丝体在半连续条件下对工业废水能起到有效的脱色与解毒作用；Ma等[88]研究发现，白腐真菌灵芝对纺织废水中活性橙16染料具有很好的脱色脱毒作用；Zhou等研究发现，韦伯灵芝(G. weberianum) TZC-1的菌丝体可使靛蓝胭脂红脱色[89]。

尽管不同品种的灵芝菌丝体对不同颜料有着不同的脱色效果，但依旧可以看出灵芝属真菌菌丝体在处理各种污水方面具有较好的潜力。

人们熟知的真菌类漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其特有的漆酶化学基团及其氧化能力使得真菌类漆酶在纸浆漂白、污水处理和染料脱色等环保领域有较大的应用价值[90-91]。王艳就韦伯灵芝(G. weberianum) TZC-1液体发酵的漆酶粗提液对多种染料的脱色进行了优化分析，发现在pH 3.0、50 ℃条件下反应120 min，对靛蓝的脱色率为92.6%[72]；在pH 4.5、20 ℃条件下反应30 min，对阳离子红2GL (cationic red 2GL)的脱色率为90.3%[92]；在pH 3.0、40 ℃条件下反应70 min，对直接耐晒翠蓝GL的脱色率为94.3%[93]。除此之外，在生物膜方面的应用上，已有研究利用灵芝废菌丝体一步固定化生产漆酶形成生物膜，经实验分析测定，形成的菌丝膜具有良好的耐热性，可使甲基紫和孔雀石绿脱色，MTT比色法(一种检测细胞存活和生长的方法)表明该膜还具有良好的生物相容性[94]。

灵芝漆酶高效脱色的效果预示着灵芝真菌液体发酵产物在环境保护方面有着广阔的应用前景。

灵芝真菌液体发酵产品的应用前景十分广阔，而且早在2012年我国科学家就已公布灵芝的全基因组序列[95]，推动灵芝成为天然药物合成研究的模式真菌[96]，这将有利于整合现代生命科学技术和深入研究次生代谢的机制及规律，为高效、可控的天然药物合成平台的建设奠定基础。

Zhou等利用农杆菌介导法建立了一种包括表达载体和转基因方法等在内的简便高效的韦伯灵芝(G. weberianum)遗传转化体系[97]，同样的方法在其他品种的灵芝上也有应用[98]；而Kim等[99]则是利用限制性内切酶介导建立了另一种灵芝转化体系。

利用转基因方法提高灵芝属真菌液体发酵高产活性物质是目前研究的热点之一，其目的是进一步提高灵芝液体发酵的效益。Li等[100]利用基因工程技术将透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)基因vgd导入灵芝菌丝细胞中，成功构建一株在液体发酵中能高产胞外多糖的灵芝基因工程菌株；倪挺等[101]将人胰岛素基因导入灵芝菌丝细胞中，通过液体发酵生产出人胰岛素。

将灵芝中编码合成某种活性物质的基因片段导入其他细胞内表达，有助于寻找一条新的液体发酵生产路线。肖建勇等[102]利用基因工程技术将灵芝中的LZ-8基因导入毕赤酵母(Pichia pastoris)中，并成功在毕赤酵母(P. pastoris)的表达系统中诱导表达LZ-8蛋白；Zhou等从韦伯灵芝(G. weberianum) TZC-1中克隆出一个新的漆酶基因，并成功转入毕赤酵母(P. pastoris)中表达[103]；Wang等[104]将灵芝中的细胞色素P450 (cytochrome P450)基因转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中并成功表达产出抗肿瘤的灵芝酸。

灵芝凭借着其独有的药理功效，自古便是一种名贵中药材，这也使得灵芝真菌成为研究最为深入的药用真菌之一[105]。正如本文第2节介绍，灵芝真菌液体发酵产物(发酵液和菌丝体)含有多种具有药用效果的活性成分。关于灵芝真菌液体深层发酵产物在医学领域的研究也正在逐渐增多，最近有研究表明，灵芝液体发酵产物对人体内肠道菌群有着积极的影响，并间接性增强人体成骨细胞的活性，对骨骼生理产生有益的影响[106]；另有报道发现灵芝发酵液能有效抑制胰腺癌细胞和前列腺癌细胞生长[107]。灵芝三萜作为一种具有广泛药理活性的物质，是目前深入研究的灵芝主要活性成分之一。李娜等[108]对液体发酵生产灵芝三萜的进展进行了综述，认为具有医药用价值的灵芝三萜类化合物可通过液体发酵技术的探索、优化和改良而进一步提高产量，为后续进一步研究灵芝液体发酵生产药用三萜类物质提供理论参考。

2019年，由北京大学基础医学院林志彬与杨宝学共同主编的Ganoderma and Health[109]一书系统地介绍了灵芝的分类学、生物学特性、人工栽培、化学成分、产业研究进展、灵芝及其提取物的药理学研究进展和临床应用等，但关于灵芝液体发酵方面的介绍比较欠缺。

目前，灵芝真菌液体发酵主要集中于液体发酵培养液及培养条件的优化、发酵产物有效成分的分析研究、液体发酵制作健康风味的饮料产品以及灵芝基因工程菌株相关产品的开发等领域。同时，关于灵芝的活性成分、药理作用与临床应用的分析研究也在不断深入，这些研究有助于人们更清楚灵芝中哪些成分最有效、性价比最大、疗效最好，也让灵芝液体发酵生产目的产物的目标更加明确，更有利于灵芝液体发酵的工业化发展。

灵芝真菌液体发酵技术及其产品在食品、医药保健品、饲料、化妆品等领域均有应用。关于灵芝真菌液体发酵的未来研究则应承前继后。

(1) 根据目的产物的不同，进一步优化相应液体发酵培养基的组成及培养条件，在最优的培养方式下最大限度地获得相关的发酵产品，寻求一种既可以满足灵芝发酵生长需求，又满足原料来源广、价格低廉、适合大规模生产的特色发酵原料替代品。

(2) 继续深入研究灵芝液体发酵产物中的活性成分及其功效。目前对于灵芝活性成分的分析主要体现在灵芝子实体上，有关灵芝液体发酵菌丝体及其发酵液活性成分的分析还应进一步深入。

(3) 随着现代生物科技的发展，进一步补充、完善灵芝真菌在微生物学、代谢组学、基因组学、发酵工程和食药用真菌学等领域的学科知识，有助于加快灵芝真菌液体发酵技术及其相关产业的发展。