WB的电泳 |
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蛋白的分子量大小e凝胶丙烯酰胺百分比4–40 kDa20%12–45 kDa15%10–70 kDa12.5%15–100 kDa10%25–200 kDa8% 丙烯酰胺是一种强的累积神经毒素：应始终佩戴手套。 按照制造商的说明将凝胶置于电泳槽中，并浸泡在迁移缓冲液中。 阳性对照使用阳性对照可以确证实验方案的有效性和正确性，特别是当抗体识别的目标蛋白在样品中不存在时。 在设计新实验时，我们强烈推荐使用阳性对照；这会使您对实验方案与结果更有信心。 分子量marker分子量 marker 使您能够确定蛋白的分子量大小，并且监控跑胶。市面上有各种分子量marker可供选择。 我们提供以下分子量marker： 分子量marker (ab48854)Prism 蛋白 Ladder (10-175 kDa) (ab115832)Prism Ultra 蛋白 Ladder (10-180 kDa) (ab116027)Prism Ultra 蛋白 Ladder (10-245 kDa) (ab116028)Prism Ultra 蛋白 Ladder (3.5-245 kDa) (ab116029) 上样与跑胶 使用专用的凝胶上样枪头或微型注射器将样品完整的加入孔中。注意不要接触到孔的底部，否则会产生扭曲的条带。 上样量不要过度。如果样品溢入相邻的加样孔中，会影响实验结果。 每孔加入 20-40 µg 总蛋白。 凝胶应该浸没在含有 SDS 的迁移缓冲液中，非变性凝胶电泳除外。 标准的 PAGE 迁移缓冲液（也称作电泳缓冲液）是 1x Tris-甘氨酸： 25 mM Tris base 190 mM 甘氨酸 0.1% SDS pH 约为8.3 按照制造商的推荐时间跑胶；不同机器的时间各不相同（根据电压，跑胶 1 小时至过夜不等）。 当染料（迁移的最前沿）到达凝胶底部时，关闭电源。此时蛋白将缓慢地从凝胶中洗脱出来，因此凝胶不要保存在溶液中；应立刻进行转膜。 内参对照内参对照是用来确认凝胶中加入的样品是否等量，特别是在比较不同样品中蛋白的表达水平时。它们也可以用于检查样品是否从凝胶转移到膜上。 甚至在还没上样或转膜时，也可以使用内参对照来定量每条泳道中的总蛋白。如需要发表文章，使用内参对照至关重要。 访问我们的内参对照指南。 下表包含常用的内参对照： 内参对照样品类型分子量注意事项Vinculin全细胞125 kDaCyclophilin全细胞24 kDaGAPDH全细胞35 kDa一些生理因素（如缺氧和糖尿病）会增加特定细胞类型中 GAPDH 的表达水平。Cofilin 全细胞细胞核细胞膜细胞骨架19 kDaAlpha tubulin全细胞细胞骨架50 kDa由于抗菌剂的抗性，微管蛋白的表达水平可能会有所不同 (Sangrajang S et al., 1998; Prasad V et al., 2000)。Beta tubulin全细胞细胞骨架50 kDa由于抗菌剂的抗性，微管蛋白的表达水平可能会有所不同(Sangrajang S et al., 1998; Prasad V et al., 2000)。Actin全细胞细胞骨架42 kDaBeta actin全细胞细胞骨架40 kDa不适用于骨骼肌样品。细胞生长条件的改变以及与细胞外基质成分的相互作用可能会改变肌动蛋白的合成 (Farmer et al., 1983)。VDAC1/Porin线粒体30 kDaCOX IV线粒体20 kDa许多蛋白的分子量与 COX IV 相近。HSP60线粒体细胞膜60 kDaLamin B1细胞核66 kDa不适用于去除了核膜的样品。HDAC1细胞核55 kDaYY1细胞核45 kDaTBP细胞核35 kDa不适用于去除了 DNA 的样品。PCNA细胞核30 kDaCdk4细胞核细胞膜34 kDaNa-K ATPase细胞膜110 kDaTransferrin血清75 kDa |
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