【专题讨论】我在SDS

2024-07-13 13:28| 来源: 网络整理| 查看: 265

我的SDS-PAGE 用了半年却还能用。10%SDS溶液两年了目前号好着呢，他是结晶的用前热水浴溶解即可，常温保存。AP用一个月肯定没有问题。快过期的甲叉试剂会使胶凝固时，梳子的齿处长短不齐。teme好像用了10年了，没有问题，不可思意哪位老师同学能帮我跑个SDS－PAGE，这只是我实验的一小部分，觉得没必要购置整套设备与药品，就做一次实验，太浪费了哦我在北京哦，谢谢我们用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做过GFP，也列下错误：1. 用错了running buffer,跑出来的带呈彩虹弧形，而且跑得非常慢2. 第一次抗体浓度过高（1/500），跑出来的带看不出浓度差异，第二次一级抗体和耳机抗体的稀释比率分别是（1/1000和1/4000），效果比较理想。3.目前正在进行中的是一次跑两批蛋白(两张胶），但是出来结果一张有一张白版，不知道是什么原因。。。10%SDS溶液的有效期为一月，常温保存。10%SDS溶液的有效期为一月，常温保存。我也是刚进实验室，尽犯些不该犯得小却致命的错误，每次都懊恼得想撞墙，现得一结论，做实验一定到认真，每次都把protocol重写一边，做到哪划到哪，省得出错。谢谢分享！90－100KDA分子量的蛋白大约用多少浓度的胶啊？我也要做小肽分子，77.5-12.5kd的，请问我的胶要多大浓度为佳。谢谢指教今天第一次灌胶所用设备为BIO-RAD 为防止漏胶先在下层小心铺一层速凝胶（可在加TEMED之前取0。5ml分离胶液于另一小器皿中然后加入10微升TEMED 然后灌速凝胶）静置3分钟后按常规方法灌分离胶浓缩胶，结果未见漏胶情况发生。另外本人在流水冲洗下拔梳子结果未见梳孔歪斜情况发生。第一次灌胶即比较成功。在做胶完成后放入4度冰箱过夜后，第二天胶与固定板接触的下缘会出现一小段空的和少量液体，像是没有固化好，为什么？速凝胶封底时出现一现象就是剥胶时发现凝胶底部出现胶皱褶现象不知如何排除望高手指教！我的错误才搞笑，刚进实验室时做胶，分离胶的配方和浓缩都弄成一样的了．还和别人讨论错误在哪里？怎么总是在分离胶就有带狂晕ing～～一次有个师弟过来告诉我,他的SDS-PAGE上不了样我有些奇怪,过去看究竟,果然,他把样品加入点样孔之后,样品不是沉到底部,而是象兰色烟雾一样从孔内飘起来,很快飘散干净感觉是样品忽然变轻了,或者----电泳缓冲液变重了后来发现原因是后者,原来他倒错了电泳缓冲液,把10倍的缓冲液倒进了电泳槽,换回来就行了相约海边 wrote:我是新手正在做WB，我想请教各位高手一个问题，我跑了三次胶每次都跑成哭脸，我求助过一些高手，说可能是胶的底部有气泡所致，我仔细看了我作的胶底部确实有许多气泡，不论我怎么小心，有时在刚灌完分离胶时没有明显的气泡，静置一会后在胶的底部回出现许多小气泡，这是什么原因呢？胶凝固后体积会缩小。你可以加少许缓冲液后把槽倾斜，将气泡赶掉。我所犯的错误也不少。没加BUFFER就煮蛋白样品，结果全沉淀了，样品只能扔掉。转膜忘了冰浴。不过，作出来的结果没有受到影响。膜上面忘了标记号，做完了不知道是什么样品了。建议用铅笔在MARKER的位置标个记号。胶冬天气温低时不容易凝固，可以将AP，TEMED加倍，放在37度里。AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最长可能用了2个月没问题，SDS放在室温，1年了，好像没什么影响。不要迷信进口抗体，进口抗体也会有时候做不出来。我们也是加大AP浓度来加快凝胶速度的，不过有一次加大太多，凝得太快跑出来条带有点歪歪扭扭的，不好看，建议30min左右聚合就可以了，太快也不好。另外我们图便宜，用了国产的槽。还不错，跟借来的Bio-rad差不多，不用封，也不漏胶，只是没有那个塑料剥胶板，便宜啊！这样已经不错了！对了最近做试验出了点新问题，新买的mark跑的时候溴酚兰居然比我的样品溶解液中的溴酚兰跑的快，老mark同时跑就没有这样的问题，不知道怎么回事，请高人指点！PS：新mark是预染mark，是不是跟这个有关啊？！meililv wrote:我觉得防止记错加样顺序的方法可以是，MARKER两边加不同个数的样本。如：MARKER左边加了4个，右边加了5个。脱色完了，一看就明白了。

我就是这样干的，个人有点懒，就经常用这个方法

wuushark wrote:前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴： 1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。 2 AP用别人旧的，结果胶不干 3 A液，B液用旧的，不干。结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。 4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝 5 电泳时长板接负极，反了 6 剥胶时，忘了切角，自已都不记得哪是哪的。再剥时，分离胶与积层胶分开了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向胶与玻璃之间注水，就可以很完整的剥下来。)

我们也是biorad的不用封底，对于APS个人觉得每个实验室应该形成一种规则，就是所有配置的溶液都写上日期和标签，并注明操作的人名，这样是一种负责的态度，除了问题很溶液找到来源，另外日期可以很明白判断是否过期，APS一般一个星期4度下，浪费也是可耻的，不要把实验室的东西不挡自己的。另外配置母液的时候最好用超纯水，这样配置的缓冲液放一年都没有什么问题。

qqkaoyan wrote:要想跑出好的胶，有条件的可以在最后加入APS或TEMED前，给混合的溶液脱脱气，效果会好些。

列举一些新人犯的错误：配胶时加错试剂；电泳时未通电或未及时通电；先上样后加缓冲液；正负极搞反；缓冲液没加够，浸没不了浓缩胶，电路不通；样品煮完没离心；电泳时未用的上样孔没1X上样缓冲；电泳过程中漏液等

我弱弱的问一句样品煮完离心的目的是什么？是不是怕盐分太高除去盐分？我做原核表达，样品是裂解的菌液，也有这个问题吗

我不怕你们笑话我做SDSPAGE时犯的错误几乎可以让你们喷饭：我上样前都没有煮变性！

to charliechou:离心是为了去除不溶性颗粒，不然会影响电泳。菌液电泳时，我感觉更应离心的彻底一些以除去细胞碎片。哦我煮之前和上样buf结合时已经用的是上清希望我们的战友们不要犯这样的错误，同样如果在做事前把会出的问题考虑清楚就不会犯这样一些低级的错误了，最关键是不要盲目。多考虑毕竟不会错的。echo100 wrote:对了最近做试验出了点新问题，新买的mark跑的时候溴酚兰居然比我的样品溶解液中的溴酚兰跑的快，老mark同时跑就没有这样的问题，不知道怎么回事，请高人指点！PS：新mark是预染mark，是不是跟这个有关啊？！我也有同样的情况，不知道是怎么回事，急！希望各位大虾能给我一些双向电泳的配方，谢谢！！sunyonghong2528 wrote:希望各位大虾能给我一些双向电泳的配方，谢谢！！

你是指胶呢？还是试剂？这有两个公司的说明书，你看一下有没有帮助

2-DE.rar (289.13k)

谢谢上面的大虾，请问sds-page和双向电泳有何区别阿？见笑！！！看完大家的讨论受益匪浅啊我也说一下自己遇到的问题1.胶凝时放入37度温箱，谁知温度比设置的高了一两度，胶凝后发现边缘不平整，所以后来我一直将温度调在34度，没出过问题，呵呵2.配好分离胶后，液面用异丙醇封闭，用枪加异丙醇时太猛了，使胶边缘凝聚的不平整。所以以后加异丙醇时要轻轻的。

在

我用bio-rad的剥胶用的塑料板照样弄碎胶，大家说操作胶的时候，这么办，才不容易把胶弄碎？

【本文地址】

【专题讨论】我在SDS

【专题讨论】我在SDS

今日新闻

推荐新闻