桑葚又叫桑子、桑枣、桑果，桑科落叶乔木桑树的果实。桑葚果实富含多种营养成分及黄酮类化合物，传统医学认为，桑葚能补益肝肾、黑发明目、养血生津，具有多种保健功能；现代医学研究发现，桑葚具有增强人体免疫力、促进造血细胞生长、防止人体动脉硬化、骨骼关节硬化以及促进新陈代谢等生理功效，被医学界誉为“二十一世纪的最佳保健果品”[1-3]。

由于桑葚是季节性水果，在常温下易出现腐烂、变色、变味等情况，不宜储藏运输，保质期短，所以将桑葚果实加工成便于运输和储藏的其他产品，对于提高桑葚的利用价值具有重要作用。目前以桑葚为原料开发的产品种类较少，主要集中在桑葚汁、桑葚酒、蜜饯、罐头、果酱、天然花色苷等产品[4-6]。其中利用桑葚酿造果酒，既有利于保持桑葚鲜果中的天然营养成分，发酵产生的次生代谢产物又能够增强桑葚酒的保健功能，具有很高的开发利用价值和市场潜力[7]。桑葚酒的品质在很大程度上与所用酵母菌的发酵特性密切相关，然而目前为止，市场上大部分果酒的酿酒均采用的是葡萄酒酿酒酵母[8]，适宜桑葚酒酿造的专业酵母菌尚未见报道[9-11]。因此，本研究筛选适宜桑葚酒酿造的专用酵母菌株，并进一步研究其发酵特性，对于提升桑葚酒品质，促进桑葚产业发展均具有一定的理论意义和实用价值。

农科院农产品加工研究所微生物实验室自行分离的桑葚酵母菌株，分别为SG1-1、SG1-2、SG1-3、SG1-4、SG1-5、SG 2-1、SG 2-2、SG 2-3、SG 2-4、SG 3-1、SG 3-2、SG 3-3，共 12 株。

YPD培养基：杭州百思生物技术有限公司；取50 g固体粉末状YPD培养基，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值至6.5左右，115℃高压灭菌20 min后冷却备用。

无水乙醇、氢氧化钠、盐酸：南京寿德试验器材有限公司；偏重亚硫酸钾：北京君悦诚品科贸有限公司；以上化学试剂均为分析纯。

SW-CJ-1B型单人单面净化工作台：上海杰兔工贸有限公司；Blue-pard生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；Five Easy Plus试验室pH计：梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；ML204电子天平：梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SHENAN灭菌锅：上海宜川上岭仪器有限公司；欧诺华榨汁机：美国伊斯曼公司；WYT糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；THZ-C-1全温振荡器：太仓市试验设备厂；LXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂。

取-20℃保存的菌种[12]，接种于YPD液体培养基中，在28℃、150 r/min的摇床培养箱内培养24 h，将菌种活化，并进行传代培养，备用。

酵母菌的初筛：将活化的菌种按8%的接种量接入到YPD液体培养基中，采用杜氏小管发酵法[13]观察各菌株的产气量和产气速率，初步获得产气能力较强的菌株。

酵母菌的复筛：耐糖、酒精、SO2、及耐酸性筛选。将得到的产气性较强的菌株分别接入到糖度为14，18，21，24，27°Bx，酒精浓度为8%、10%、12%、14%、16%、18%，SO2含量为 60、80、100、120、140 mg/L，pH 值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 的 YPD 液体培养基中，28 ℃静置培养，48 h后分别观察杜氏小管的产气情况。进一步筛选出对糖度、酒精度、SO2、酸性耐受性较强的菌株。

1.2.3.1 酵母菌最适温度测定

将筛选得到的SG3-2酵母种子液按8%接种量接种于 21 °Bx的桑葚汁中，分别于 20、23、25、28、30、33、35℃条件下培养5 d，于600 nm波长下测定菌悬液的OD值，依据OD值的大小确定其最适温度。

1.2.3.2 酵母菌耐酸能力的测定

将筛选出的SG3-2酵母种子液分别接种于pH值为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的桑葚汁（21 °Bx）中，28 ℃的恒温培养5 d，在600 nm波长下测吸光度，根据吸光度的大小判断SG 3-2菌株的耐酸性能。

1.2.3.3 酵母菌耐酒精能力的测定

将筛选得到的SG3-2酵母种子液按8%的接种量分别接种于含不同乙醇体积分数（8%、10%、12%、14%、16%、18%）的桑甚汁（21°Bx）中，28℃条件下恒温培养5 d，在600 nm波长下测OD值。

1.2.3.4 酵母菌耐SO2能力的测定

21°Bx的桑葚汁中加入偏重亚硫酸钾，使SO2浓度分别为 60、80、100、120 、140、160 mg/L，接入 SG3-2酵母菌种子液，28℃条件下培养5 d，600 nm处测其吸光度，依据OD值大小确定其对SO2的耐受能力。

取装有200 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶1个，不接种酵母菌，作为空白对照。

将菌种SG3-2接种于灭菌的YPD液体培养基中，置于28℃的恒温培养箱中进行培养，每隔4 h取样，在560 nm处测定其吸光度，根据检测结果绘制菌株的生长曲线。

分离的酵母菌株采用杜氏管发酵法，在28℃的恒温培养箱中培养24 h时，有少量气体产生，而48 h后大多数菌株都有大量气体产生，其中7株酵母菌株产气量约等于杜氏小管的体积，分别为SG1-4、SG1-5、SG2-3、SG2-4、SG3-1、SG3-2、SG3-3，说明这些菌株发酵能力旺盛，酵母菌株的产气情况见表1。

表1 酵母菌株的产气情况Table 1 Gas-producing conditions of yeast strains

注：“+”产气量为杜氏小管体积的1/3；“++”产气量为杜氏小管的2/3；“+++”产气量为杜氏小管满体积。

发酵时间/h 产气情况 菌株数（株）24 + 5++ 4+++ 3 48 + 3++ 2+++ 7

在不同酸度的液体培养基中培养酵母菌，可以筛选出耐高酸性的菌株见表2。由表2可以看出，在产气性良好的7株菌株中，当pH值为2.0时，所有菌株都不能生长，而pH值等于2.5时，有5株能产生大量气泡，分别为 SG1-4、SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，说明这5株菌株耐酸性较强，在高酸性环境中仍能正常生长。当pH值大于3.0时，所有菌株均有大量气泡产生。

表2 酵母菌耐酸性试验结果Table 2 Test result of acid-resistance of yeasts

注：“——”表示没有气体产生；“+++”产气量为杜氏小管满体积。

pH值 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0产气量 — +++ +++ +++ +++菌株数 0 5 7 7 7

在不同糖度的培养基中，菌株的生长情况也有所不同见表3。由表3可以看出，当糖度小于18°Bx时，所筛选出的5株耐酸性较强的菌株均有大量气泡产生，而糖度大于21°Bx时，则其中有4株菌株生长良好，有大量气泡产生，分别为SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，将这4株菌株作为耐SO2能力测试的出发菌株。

表3 酵母菌对糖度的耐受性试验结果Table 3 Test results of glucose-tolerance of yeasts

注：“+++”产气量为杜氏小管满体积。

糖度/（°Bx）1418212427产气量 +++ +++ +++ +++ +++菌株数 5 5 4 4 4

在培养基中添加偏重亚硫酸钾，可筛选出能耐高浓度SO2的菌株见表4。如表4，在酵母菌耐SO2试验中得到的4株出发菌株在SO2浓度小于100mg/L时，杜氏小管中均有大量气泡产生，当SO2浓度达到120 mg/L时，有一株菌株无气泡产生，说明其不能耐受较高浓度的SO2，而其他3株均可以耐受140 mg/L的SO2且产生大量气泡，其编号分别为SG1-5、SG3-2、SG3-3。

表4 酵母菌耐SO2性能试验结果Table 4 Test results of yeasts tolerance to SO2

注：“+++”产气量为杜氏小管满体积。

SO2浓度/（mg/L）6080100120140产气量 +++ +++ +++ +++ +++菌株数 4 4 4 3 3

根据以上试验所筛选出的3株优良菌种，进行不同乙醇浓度的耐受性试验见表5。结果显示，乙醇浓度小于12%时，3株菌株均能正常生长，当乙醇浓度为14%时，其中有两株（编号为SG1-5和SG3-2）菌株有气体产生，当浓度达到16%时，仅有1株能正常生长，编号为SG3-2。通过以上试验，所筛选出的SG3-2菌株产气性能好，耐酸性，耐SO2，耐乙醇能力较强，可作为桑葚果酒发酵的优良酵母。

表5 菌株的耐酒精测定结果TabIe 5 Determination results of alcohol-tolerance of strains

注：“+++”产气量为杜氏小管满体积。

酒精浓度/% 8 10 12 14 16产气量 +++ +++ +++ +++ +++菌株数 3 3 3 2 1

酵母菌对温度的耐受性试验见表6。由表6可以看出，SG3-2酵母菌在不同的温度条件下，其菌悬液的OD值不同，说明各发酵液中菌体浓度不同。当温度从20℃不断升高时，发酵液的OD值也不断增大，当温度达到30℃时，其OD值达到最大，当温度再升高时，菌悬液的OD值有所下降，说明酵母菌的死亡速率大于新生速率。SG3-2最适生长温度为30℃，但在果酒发酵过程中，若温度过高，则会导致酒体风味变差，所以在实际发酵时，其发酵温度应低于30℃。

表6 酵母菌对温度的耐受性试验Table 6 The tolerance test of yeast to temperatures

温度/℃ 20 23 25 28 30 33 35 OD600值 0.423 0.506 0.572 0.625 0.682 0.601 0.596

酵母菌耐酸性试验见表7。由表7可以看出，SG3-2酵母菌在pH值为2.0～7.0范围内均能生长，且随着pH值的逐渐增大，其OD值也逐渐变大，当pH值达到4.0时，OD值达到最大，pH值继续增加，其OD值减小。说明pH值为4.0时，菌体浓度最大，酵母菌生长最为旺盛，低酸性环境不适合酵母菌SG3-2的生长，所以其最适pH值为4.0左右。

表7 酵母菌耐酸性试验Table 7 The test of acid-resistance of yeast

pH值 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 OD600值 0.473 0.689 0.804 0.644 0.601 0.462

在不同乙醇浓度的的培养基中，酵母菌的生长情况不同见表8。当乙醇浓度由8%到14%逐渐增大时，培养液的OD值逐渐增大，乙醇浓度为14%，OD值最大，酵母菌生长速率最快，最适合果酒发酵，当乙醇浓度再增加时，其OD值逐渐变小，说明较高浓度的乙醇则会抑制酵母菌的生长。

表8 酵母菌的耐酒精能力Table 8 The alcohol-resistance of yeasts

乙醇浓度/% 8 10 12 14 16 18 OD600值 0.545 0.560 0.596 0.705 0.676 0.597

在发酵前往桑葚汁中加入SO2，不仅可抑制杂菌的生长，还可以防止色素被氧化。因此，具有较强的SO2耐受性的酿酒酵母有利于优质桑葚酒的酿造，酵母菌的耐SO2能力见表9。通过表9可以发现，随着SO2浓度的增加，发酵液的OD值逐渐减小。当SO2浓度为100 mg/L时，OD值减小了25%，当SO2浓度为120 mg/L时，OD值减小了42%，说明SO2浓度较高，对酵母菌的生长抑制作用越大。因此最适的SO2浓度为 100 mg/L～120 mg/L。

表9 酵母菌的耐SO2能力Table 9 The resistance to SO2of the yeasts

SO2浓度/（mg/L）6080100120140160 OD600值 0.687 0.604 0.515 0.396 0.334 0.302

酵母菌SG3-2的生长曲线如图1。由图1可以看出，随着培养时间的增长，培养液的吸光度逐渐增大。SG3-2生长的对数期为4 h～16 h，稳定期是16 h～28 h，在此期间，菌株活力最强，生长最为旺盛。在28h时，吸光度达到最大值，是菌株取样的最佳时期。28 h后进入衰退期。菌株SG3-2的对数期和稳定期都较长，有利于产生代谢物质和发酵果酒，因此可作为桑葚果酒酿造的优良酵母。

图1 菌株3-2的生长曲线Fig.1 The growh curve of the yeast SG3-2

不同酵母菌种的发酵能力，产酒精能力和对发酵环境的适应性不同，所得到的果酒的风味和质量也不同。优良的菌株不仅发酵速度快，发酵能力强，而且可以产生良好的酒香和果香味。从桑葚中分离得到的12株酵母菌株，通过杜氏管发酵法和吸光光度法，可得到一株耐酸性，耐SO2及耐酒精能力强的菌株，该菌株在pH值为4.0～4.5，SO2浓度为100 mg/L，酒精浓度为14%的条件下，仍然能够正常生长，而且在生长到28 h时，生长最为旺盛。

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