文章发表在 Science 上

研究者提出的原位基因组测序（IGS）可以直接在完整的生物样品内进行DNA测序，在内源环境中对全基因组的配对末端序列进行空间定位，从而桥接测序和成像模式以绘制基因组图谱。首先，研究者通过在自然空间环境中扩增基因组的非靶向样本，在固定样本中创建一个原位测序文库；然后，将原位测序与高通量双末端DNA测序相结合，在原位测序后，可进行免疫染色及成像循环，从而确定扩增子的序列和3D位置；最后，将非原位配对末端测序读数与原位扩增子位置进行计算匹配。之后研究者将IGS应用于106个人类成纤维细胞（PGPlf）和113个早期小鼠胚胎中不同发育阶段的细胞，结果显示66.35%的清晰可分辨扩增子与非原位基因组读数相匹配（图1）。

图1. 原位基因组测序方法（IGS），来源：Science

为了验证IGS方法检测空间基因组组织的特征，研究者首先检查了间期人类男性PGP1成纤维细胞中的染色体位置，再通过计算基因组中成对基因组位置之间的平均空间距离来表征单细胞中二倍体染色体区域的位置。结果显示长度较短的染色体倾向于靠近核中心，这与之前对人类成纤维细胞的研究结论一致，进一步证明IGS能够分辨单细胞细胞核内的二倍体染色体区域并研究染色体的空间定位。接下来研究者应用IGS实现了同时测量基因组中重复序列的定位，并发现某些类型的重复异染色质（如卫星DNA）显示向核中心富集，而其他类型的异染色质在核边缘过度分布，这表明IGS能够以非靶向和全基因组的方式同时识别许多不同重复序列的空间定位模式。最后，研究者通过对空间极化染色体臂进行观察研究，发现IGS可以表征单个染色体的结构。综上所述，这些发现突出了IGS具有同时探究基因组组织广泛特征的能力，包括染色体定位、染色体折叠和重复序列的定位模式（图2）。

图2. IGS表征人类基因组的空间特征，来源：Science

基因组的空间结构在早期胚胎发育中被广泛重塑，鉴于空间特征、序列特异性和细胞间关系在表观遗传重塑等现象中的重要性，研究者将IGS应用于早期小鼠胚胎中不同发育阶段的细胞（PN4受精卵、晚期2-细胞和早期4-细胞），以表征早期胚胎发育中的基因组组织。对相关标志物（着丝粒、核层和核仁前体（NPBs））进行联合免疫染色，直接定位相对于这些标志物的基因组读数以研究标记物的组织作用，根据产量、核型、发育阶段和细胞周期筛选细胞，结果发现非共定位读数在核层和NPBs近端区域显著耗尽。为了确定每个区域的亲本来源，研究者鉴定了任一亲本中与杂合SNP重叠的基因组位置的空间定位读数，1.40%和1.64%的基因组读数分别分配给母本和父本，又通过可视化单倍型信息读数在PN4受精卵中的位置验证了以上分配。胚胎发育阶段，亲本基因组仍然分离在较大的父核和较小的母核中，基于该特征，研究者以半监督方式将每个染色体区域分配给母本或父本基因组，结果显示97.1%的单倍型信息读数与该分配一致（图3）。

图3. 应用IGS对完整的早期小鼠胚胎进行高分辨率的基因组和空间分析，来源：Science

接下来，研究者聚焦于前述的全基因组组织原理，重点关注亲本单倍型、着丝粒-端粒位置及GC含量。研究者分析了每个读数的空间染色体间邻居并计算了单倍型空间分离得分，结果显示平均分离得分的标准差随着发育阶段的延长而增加，表明亲本基因组在胚胎内的混合程度是具有异质性的，逐渐混合是有丝分裂后全局染色体重新定位的结果。然后，研究者检查分析了基因组沿着染色体的着丝粒-端粒轴的整体空间结构，结果显示2-细胞和4-细胞阶段的着丝粒显著聚集在细胞核的一侧，并可观察到着丝粒-端粒评分高度极化，通过量化发育阶段的极化，发现2-细胞和4-细胞阶段的相关性比受精卵阶段强，但这两个阶段细胞胚胎中向Rabl样构型转变的功能后果尚不清楚。最后，研究者检查了GC含量在基因组结构中的作用，结果显示GC含量与Chr12跨核层的距离在父本和母本同源物中均存在相关性，且在受精卵中父本同源性显著高于母本同源性，但在2-细胞阶段不存在该现象，这表明GC区室化程度可能受原核的不同生物学历史的影响（图4）。以上结果表明IGS能够以亲本特异性分辨率和核标记来描述不同发育阶段的3D基因组组织。

图4. IGS表征胚胎基因组组织的发育转变，来源：Science

图5. IGS揭示受精卵中的单细胞结构域，来源：Science

胚胎发育涉及通过单个胚胎内的克隆细胞谱系进行染色质组织结构和调节特征的表观遗传学传递。前人研究发现染色体区域在间期早期形成，随后保持其相对位置直到前期，因此比较染色体定位可以量化间期细胞之间全基因组组织上的相似性。研究者通过比较单个胚胎内和胚胎间成对细胞的单细胞常染色体距离矩阵来量化相似性，结果表明2-细胞胚胎中的细胞可能在受精卵中期共享它们共同的初始染色体定位记忆。接下来，研究者在每个4-细胞胚胎内构建了假定的克隆谱系树，对假定的姊妹细胞和表亲细胞进行分类，结果证明了在早期胚胎中染色体整体定位的克隆谱系特异性相似性，并暗示染色体定位的表观遗传记忆在第二次卵裂过程中从母体细胞传递到子体细胞，虽然其机制尚不完全清楚，但这种记忆可能反映了染色体在向中期板聚集和离开中期板过程中的最小相对重定位。这种整体染色体定位的有丝分裂遗传性可能会影响发育中生物体的生存能力和表型。

图6. IGS揭示单个胚胎中整体染色体定位的表观遗传记忆，来源： Science

综上所述，该研究利用IGS技术同时实现了人类成纤维细胞和早期小鼠胚胎中基因组的测序和成像。该技术可以跨尺度从单个碱基对整个有机体，直接连接DNA序列和3D空间结构，有助于研究人员对全基因组信息的精确认识。

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