5. 蛋白质高级结构 脱酰胺作用不仅取决于蛋白质的一级结构，还取决于其三维结构。文献报告，在IgG1中，七个Asn残基中只有两个（Asn54和Asn56）对脱酰胺反应敏感，这种差异是由于连续残基的构象动力学导致的[2]。另外抗原-抗体复合物的脱酰胺反应不会导致异天冬氨酸的形成，这表明抗原-抗体复合物可防止来自特定方向的水的攻击，这很可能是由于抗原与抗体结合时的空间位阻或局部构象变化[3]。

脱酰胺反应的表征方法

脱酰胺产物的表征是复杂的，因为该反应产生四种不同的Asp异构体，包括L-Asp和L-isoAsp以及不太常见的D-Asp、D-IsoAsp。所有脱酰胺产物都给蛋白质带来负电荷，每个异构体以不同的方式影响结构和功能。

脱酰胺表征的方法有很多，如下表所示，不同方法各有优缺点。IEF基于等电点分离，因此仍然是鉴定脱酰胺作用的常用技术。然而，它的灵敏度、特异性和准确性较低。CZE、CE和IEX-HPLC根据电荷异质性分离脱酰胺产物，而RP-HPLC根据疏水性或极性变化分离。CE和HPLC的主要局限性是灵敏度低和检测限高（即约为总蛋白质的1%），但它通常用于制药行业的常规质量控制。

基于质谱的分析（LC-MS或LC-MS/MS）具有更高的灵敏度，是检测PTM的“金标准”。脱酰胺反应导致质量增加约+1 Da，这很容易通过灵敏的MS方法检测到。但是质谱的样品前处理过程很可能引入人为脱酰胺反应，因此在前处理过程中需优化条件，减少样品在实验过程中发生脱酰胺反应导致的假阳性。文献报道，曲妥珠单抗血浆样品在37°C、pH 7条件下消化三小时，消化效率合理（>80%），并且消化过程中形成的脱酰胺产物最少（