1.1 S1核酸酶处理工艺的确认

mRNA和dsRNA由于片段长度差异可以在电泳中有不同的迁移表现，而 S1核酸酶是一种降解单链核酸的酶（图 2a），用在微流控表征之前，以确保样品中仅剩余dsRNA片段。S1 核酸酶的引入不可避免地使得体系中也加入了EDTA，EDTA因其能够螯合核酸酶所需的镁离子以保护核酸免于进一步降解，而得到普遍使用，但过量使用EDTA会影响微流控分析的性能。根据图2c-2g的结果，EDTA的添加与否对于电泳中dsRNA的迁移与否没有影响，就此作者认为EDTA 似乎不会影响酶切性能，因此将其从工艺中删除。但在初始设定的酶切反应条件下，dsRNA检测的灵敏度较低。因此S1核酸酶处理的反应条件有待进一步优化，例如mRNA样品浓度、酶的用量、缓冲液等。

图2 S1核酸酶处理对mRNA和dsRNA的影响

1.2 酶解缓冲液与酶的比例优化

为进一步提高方法的灵敏度，文章进一步选择了起始mRNA浓度、酶解缓冲液与酶的比例作为因素变量，每个因素设定3个水平进行初筛。如图3所示，在条件13即酶解缓冲液浓度为1/16×SOP，酶浓度为10×SOP，mRNA浓度为1×时，在保有dsRNA较高峰面积的情况下，杂峰面积也达到了可控的最低水平。

图3 酶切反应因素和变量的筛选（SOP起始条件：mRNA 10ng /μL，Buffer浓度9%v/v，Enzyme浓度0.3% v/v）

为确保方法的稳健性，作者也用不同的mRNA浓度（10、100 和 200 ng /μL）比较了条件13与次优条件14（1/8×缓冲液，10×酶）。结果如图4所示，在这两种方法下，杂峰与dsRNA峰之间均无重叠；但在较高浓度下，两种条件虽然拥有相似的dsRNA 峰面积，条件13的杂峰含量则更高。因此，条件14进一步被优选为最佳工艺。

图4 最优工艺确认

二、dsRNA分析方法验证

完成方法搭开发后，作者最后在长度依赖性、灵敏度以及dsRNA长度预测能力上进一步对其完成了验证。为评估方法的长度依赖性，作者在不同长度的 dsRNA（1 ng/μL）和不同长度mRNA（200 ng/μL）组合下进行了测试。结果如图5所示，所有的测试样品中，mRNA峰都被完全消化，而700和1800 bp的dsRNA均得以保留，且迁移时间不同，该方法可以无干扰地鉴定同一样品中的不同dsRNA杂质。根据在1.0、2.5和5.0 ng/μL 700 bp dsRNA的检测结果来看，峰面积和浓度之间有很强的相关性，且利用该方法的灵敏度结果可信度强，dsRNA的最低检测限可达0.32 ± 0.07 ng/μL。

此外，文章最后也对上述方法测试dsRNA杂质长度的能力进行了验证。结果，方法可以准测判断出dsRNA杂质的长度，平均误差仅为8%，同时也显示了其对化学修饰与否的样品均有相同的准确性。

图5 方法验证结果

三、结论

本研究提出了一种检测mRNA制品中dsRNA杂质的微流控电泳法，为有害副产物dsRNA的分析提供了一种快速、高通量的分析工具。该方法仅需 10~15 μL 样品，酶处理后每个样品的分析运行时间为 1 min，对96 孔板和 384 孔板兼容，并且酶处理可以直接在孔板上进行。

此方法兼具微流控系统和酶鉴定优势，使用 S1 核酸酶消化样品中的所有单链片段，只留下 dsRNA 片段。通过不断对方案中的各项参数进行优化，对起始mRNA浓度、酶解缓冲液与酶的比例进行不同因素不同水平的全方面筛选比对后，得到了最佳实验条件为（1/8×缓冲液，10×酶）。利用该技术，可最低完成0.32 ± 0.07 ng/μL、0.16%限度的dsRNA检测，且对dsRNA长度的准确推测可达92%。唯一不足的是，标品必须与样品在同一块板上运行，以此来拟合分子量标准峰长度上的迁移，以生成标曲完成dsRNA长度的确认。

参考文献

[1] Coll De Peña A, Vaduva M, Li NS, Shah S, Ben Frej M, Tripathi A. Enzymatic isolation and microfluidic electrophoresis analysis of residual dsRNA impurities in mRNA vaccines and therapeutics. Analyst. 2024 Feb 26;149(5):1509-1517. doi: 10.1039/d3an02157b.

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