通过微生物相关生物标志物预测临床结局是目前的研究热点，也是非常有前景的研究领域[1~3]。

人类肠道中的微生物对健康的重要性逐渐引起人们的关注。人类肠道内有多种微生物，包括细菌、古菌、真菌、真核生物和病毒（包括噬菌体、攻击细菌或古菌的病毒等）。这些微生物统称为 microbiota，它们的基因被称为 microbiome[4]。

肠道微生物多样性与影响人类健康的生物变化存在着直接或间接的关联[5]。因此，深入了解微生物多样性对健康的影响，是临床专业研究的需要拓展的一个研究领域，涉及从精神病学到胃肠病学等一系列学科[6]。

例如，炎症性肠病疾病的动态变化以及在不同采样部位存在的差异性，都会产生不同的微生物组结果[7，8]。回肠采集的活检样本预测能力最高，其次是直肠活检和粪便样本。然而，有研究表明，将单个受试者多次粪便样本混合，其预测有效性与回肠活检样本（收集困难，费用昂贵）基本一致[9]。

综上，微生物组的时间变异性，提示其可能是炎症性肠病甚至其它疾病的潜在标志物。

由于微生物的这些潜在应用，关于微生物组的研究迅速增长，包括学术界、社会企业甚至临床研究机构。因此，成功实施临床微生物组学研究，有几个步骤至关重要。

最近的综述中详述了实验设计中的影响因素，如样品采集和储存[11]，样品制备方法[4]和分析方法[12,13]。本文通过列举两个案例，来阐述一个简单微生物组研究所需的受试者样本量和把握度计算方法。

为了简便起见，本文中给出的两个例子均采用同一个研究 QIITA。

例一中，采用了一种称为 Faith's PD[14] 的方法来评估微生物多样性，该方法将微生物的系统进化树作为因变量。PD 描述了单个样本中微生物群落的多样性（α 多样性），同时也考量了这些微生物的系统发育结构。

例二中，采用了一种称为 UniFrac（β多样性）的距离度量法，比较了3种不同临床表型/类别微生物多样性之间的差异[15]。UniFrac 也使用了系统进化树；并通过对菌群的 α 和 β 多样性进行测定，取代了单纯利用已知的分类列表。

相比较之下，单纯利用已知的分类列表的证据力度相对较弱，因为该方法忽略了微生物群之间的相互作用（例如，分类列表法中认为大肠杆菌和沙门氏菌的不同之处，跟它们与芽孢杆菌不同是一样的）。

例一用于推动临床生物标志物研究的标准样本量的计算，而例二则解决的是多元模型和距离矩阵的复杂性。

一项临床研究对两组不同克罗恩病（CD）患者的微生物群落多样性进行了比较。虽然克罗恩病病灶位置一致，但在整个病程中其表型可能有明显差异[16]。

研究假设 H0 为：假设肠道微生物群落差异与克罗恩病表型有关。

为检验该假设，研究将对患有克罗恩病非狭窄非穿透型（B1 型）和患有狭窄型（B2 型）或穿透型（B3 型）的患者进行比较。为了确定每组能够检测出微生物多样性差异的最少受试者人数，研究特意咨询了当地的统计学专家。为进行样本量计算，统计学家可能会问到以下几个问题：

1A：目标人群菌群多样性分布的现状如何？

一项可能的研究设计，需要连续纳入确诊为克罗恩病 B1 或 B2/B3 型的患者（B1组vs B2/B3组）。为了方便起见，本文假设所有表型招募难易程度基本相同，推荐组间受试者比例为 1:1。每次随访，患者需要提供一份粪便样本，采用 16S rRNA 标记基因法对菌群群落进行分析。

需要注意的是，对于初步探索研究来说，标记基因法完全可以检验研究假设；但是如果关注的是某一个特殊菌株或功能基因和通路，那么就需要完全不同的测序技术，那么就必须对额外获取数据成本（包括过程成本和数据分析成本）与获得信息是否对等做出权衡。

在上述案例中，研究中克罗恩病患者肠道菌群 α 多样性分布未知，但是存有一项相似的研究，并且该研究及其数据已经公开[17]。该分析结果表明，100 个 B1 型克罗恩病患者的 PD（用于计算菌群 α 多样性参数之一）呈正态分布。PD 的平均值和标准误差分别为 13.5 和 3.45（见图1）。

图1：标准样本量计算。确定在 B1 组和 B2/B3 组患者肠道菌群 α 多样性（Faith PD）存在显著差异，且在3个效应值（PD差异为2、3、4，相当于 Cohen D 为 0.55、0.82和1.09），把握度为 80%。

图表结果显示，尽管在样本量为 20 时即可得出显著性差异（α