背景技术：

6.rack1(活化c激酶1受体)是一种高度保守的支架蛋白，具有许多正常功能，包括pkc转导、mirna调节和通过结合真核生物小(40s)核糖体亚单位(1)进行蛋白质翻译。据报道，细胞rack1在显示tdp43或tau病理学的细胞中聚集(2,3)。7.rack1是一种色氨酸、天冬氨酸重复序列(wd-重复)蛋白质，采用七叶β-螺旋桨结构。rack1是真核生物40s核糖体亚单位的核心核糖体蛋白；与》100个蛋白质相互作用的支架蛋白，从而调节对细胞增殖、转录、蛋白质合成和神经元功能至关重要的各种信号通路；参与翻译调控和核糖体质量控制；以及在胞浆、内质网(er)和细胞核中表达。rack1在进化过程中高度保守。人类rack1与小家鼠、褐家鼠、黑腹果蝇、拟南芥和酿酒酵母的氨基酸序列同源性分别为100％、100％、76％、64％和53％(4)。8.据报道，rack1与野生型和突变型亨廷顿蛋白(htt)相互作用，htt是一种与亨廷顿病相关的基因(10)。9.tar dna结合蛋白43(tdp-43)是一种众所周知的rna/dna结合蛋白，参与als和额颞叶痴呆(ftld)的发病机制(5)。tdp-43主要定位于细胞核，在细胞核中参与rna的表达和剪接，而在细胞质中，其功能从运输到翻译特定的mrna(6)。tdp-43与翻译机制的结合是通过与rack1的相互作用介导的，细胞质tdp-43的增加抑制了全局蛋白质合成，这种作用可通过野生型rack1过度表达来挽救(2)。tdp-43代表整体翻译的阻遏物，其通过rack1与多核糖体结合可促进细胞质内含物的形成(2)。在存在核糖体结合缺陷突变体(de-rack1)蛋白的情况下，核定位信号缺陷(dnls)tdp-43蛋白聚集减少，与翻译机制无关，并且dnls tdp-43的整体翻译抑制得到缓解(2)。10.融合于肉瘤/转位于肉瘤(fus/tls)fus是一种rna/dna结合蛋白，主要定位于大多数细胞类型的细胞核(6)。据报道，有fus突变的als患者的大脑和脊髓神经元中fus的细胞质聚集(6)，并且约10％的ftld无突变(即野生型蛋白)(11)。11.已经描述增加或减少rack1表达的分子。12.pct/gb2007/003447将多巴胺受体相互作用蛋白描述为疾病标记，并描述了确定一种或多种核酸序列的变体形式的存在或缺失，包括gnb2l1(rack1)基因，其中变体的存在表示疾病或对疾病的易感性。13.us8916530专利描述了个体化癌症治疗的方法，并提到了用于敲除上调的rack1基因表达以治疗癌症的特定反义/shrna/sirna序列。14.us15/844601描述了一种通过给药作为癌症治疗来提高包括gnb2l1在内的基因表达水平的方法。15.pct/ep2019/065116描述载药细胞外囊泡的基于亲和力的分离和纯化，例如外显体，其中外显体被设计成能够进行亲和力纯化。16.cn101985037描述使用特定sirna或反义寡核苷酸抑制rack1基因治疗肿瘤。17.tdp-43病或fus病的额外治疗是可取的。

技术实现要素：

18.在本文第一方面中公开一种低聚物化合物，包含与选自seq id no:1-16、49-51或289-499中任一种的核酸靶的至少一部分互补的部分。19.在一个实施例中，所述低聚物化合物的长度为14到40个核苷酸。20.在一个实施例中，核酸靶序列选自seq id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-499中的任一种。在一个实施例中。核酸靶序列选自seq id no:2-6、8、10-16、49-5 1、292-294和296-298中的任一种。在一个实施例中。核酸靶序列是选自seq id no:2、3、292、297和298中任一种的序列。21.靶序列位于rack1 mrna或pre-mrna中。人类rack1 mrna的序列在例如ncbi参考序列登录代码nm_006098.5中提供，并且具有seq id no:500。人类rack1-pre-mrna的序列在例如登录代码nc_000005.10序列索引181236897至181248096中提供。22.在一个实施例中，该部分与核酸靶序列互补，并且该核酸靶序列是或包括选自seq id no:1-16、49-51和289-499中任一种的序列。在一个实施例中，该部分与核酸靶序列互补，并且该核酸靶序列是或包括选自seq id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-499中任一种的序列。在一个实施例中，该部分与核酸靶序列互补，并且该核酸靶序列是或包括选自seq id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-298中任一种的序列。在一个实施例中，该部分与核酸靶序列互补，并且该核酸靶序列是或包括选自seq id no:2、3、292、297和298中任一种的序列。23.低聚物化合物可由天然存在或改性单体或其组合组成。低聚物化合物可以是单链或双链，并且可以是rna、dna或dna/rna杂交(例如单链或双链)。24.低聚物化合物可以是反义寡核苷酸，例如包含seq id no:78-288中任一种，优选seq id no:81-83和85-87中任一种，并且更优选seq id no:81、86和87中任一种。25.低聚物化合物可以是sirna化合物，其靶向核酸靶标之一，并包含天然或非天然悬垂序列。26.在一个实施例中，sirna包含引导链，该引导链包含seq id no:17-32和52-54中任一种的序列。27.双链低聚物化合物，如sirna序列，可以具有相同的3′‑悬垂序列或不相同的3’悬垂序列。一种可是本地的并且另一种可不是本地的。28.低聚物化合物可以是shrna。在一个实施例中，低聚物化合物包含一种或多种细胞穿透部分。29.在另一方面，公开包含本文所公开的低聚物化合物的载体。30.在另一方面，公开包含所述低聚物化合物或载体和稀释剂的组合物。31.公开的方面涉及一种治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病的方法，任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)，该方法包括敲除中枢神经系统细胞、特别是需要的受试者的神经元和/或星形胶质细胞中的rack1 rna，任选rack1 mrna和/或rack1 pre-mrna。32.公开的另外方面涉及一种治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病的方法，任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)，该方法包括向需要的受试者施用一种或多种反义分子，任选地施用一种或多种本文所述的低聚物化合物。33.另一方面是一种减少或抑制细胞中tdp-43和/或fus聚集的方法，该方法包括向细胞中任选地引入本文公开的一种或多种反义分子(任选地靶向rack1的一种或多种所述低聚物化合物)、组合物和/或载体，以足够量和足够时间降低细胞中的rack1水平。34.另一方面是本文公开的一种或多种反义分子、组合物、载体和/或方法用于在需要的受试者中治疗任选地选自肌萎缩侧索硬化(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆(ftld)，例如tdp-43型ftld或fus型ftld、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关tdp-43脑病(late)的tdp-43病、或减少或抑制细胞中的tdp-43和/或fus聚集中的用途。35.在一个方面中还提供一种或多种反义分子、组合物、载体和/或本文所述的方法在需要的受试者中治疗任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)的tdp-43病中的用途。36.此外，一个方面包括本文公开的一种或多种反义分子、组合物、载体和/或方法在制备治疗任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)的tdp-43病的药物中的用途。37.在一个实施例中，反义分子，任选地低聚物化合物是反义寡核苷酸、sirna或shrna。附图说明38.现在将结合附图描述本发明的一个实施例，其中：39.图1是野生型和dnls tdp-43(ha)和rack1细胞染色的一系列图像。40.图2是fus(ha)和rack1野生型和不同突变体染色的一系列细胞图像。41.图3是sod1(sod100)和rack1不同突变体染色的一系列细胞图像。28d)或a6(图28e-28h、28k、28l)所示。未驱动对照如a6所示(图28i、28j)。67.图29显示退化分数保持在1的苍蝇百分比。68.图30显示用不同aso处理的hela细胞中rack1检测的western blotting结果。泳道装载对照：微管蛋白69.图31是显示aso处理的hela细胞相对于未处理(ut)细胞中rack1蛋白表达的条形图，设置为1并用上虚线表示。具体实施方式70.除非另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包含单数。例如，术语“细胞”包括单个细胞以及多个或群体细胞。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关联的术语和技术是本领域中众所周知和常用的术语(参见例如green和sambrook，2012)。71.如本文所用，术语“给药”意指通过任何有效途径，例如鞘内、脑室内、脑实质内或鼻内给药途径，向受试者提供或给予化合物或分子，例如包含反义分子的组合物、选择性地包含本文所公开的低聚物化合物或包含反义化合物的载体，例如shrna。72.如本文所用，术语“有效量”是指化合物或分子的量，例如反义分子，例如，反义寡核苷酸或抗rack1 sirna，其足以产生所需反应，例如减少或消除rack1蛋白，tdp-43聚集和/或fus聚集或治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病，如肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)。73.本文中使用的术语“治疗”或“治疗”是指获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于缓解或改善一个或多个症状或条件，减轻疾病范围，稳定(即不恶化)疾病状态，防止疾病传播，延缓或减缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，减少疾病复发，和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测。如果不接受治疗，“治疗”和“治疗”也可能意味着与预期生存期相比延长生存期。例如，患有早期als或ftld的受试者可以使用反义分子(如本文所述的低聚物化合物)治疗，以防止疾病进展，例如防止神经退行性变恶化。74.如本文所用，术语“稀释剂”是指药学上可接受的载体，其不抑制待给药的活性化合物的生理活性或性质，不刺激受试者，并且不废除所给药化合物的生物活性和性质。稀释剂包括本领域技术人员已知的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、盐、防腐药、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂，例如材料及其组合(例如，参见remington’s pharmaceutical sciences，18ed.mack printing company，1990，pp.1289-1329，通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于药物组合物中。75.如本文所用，术语“互补”是指反义分子(例如本文公开的低聚物化合物)或其一部分与rack1 rna的目标序列杂交的能力，例如rack1mrna和/或rack1 pre-mrna，从而“击倒”rack1(例如，将rack1的mrna和(或)前mrna减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％以上)。反义分子和目标rna之间的互补性可能是完美的(100％互补)，但一些错配是可以容忍的。例如，反义分子可以与目标rna互补70％、80％、85％、90％或95％，或者在任何10个单体拉伸中包含多达1个、2个或3个错配。76.如本文所用，术语“反向补体”是指核酸序列在其5'至3'端方向上的互补链。例如，如果5'到3'方向的序列是tccagagacatctgccggt(序列id no:81)，其反向补码是accggagattgtctgga(序列id no:292)。77.如本文所用，“至少部分互补”是指反义分子，例如本文所公开的低聚物化合物，其与rack1 rna(例如rack1 mrna或rack1 pre mrna)具有足够的互补性，以降低rack1水平，如例如体外检测所测得的。“对至少部分的补充”包括例如对rack1 rna的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个相邻核苷酸的补充。78.如本文所用，术语“反义分子”包括例如本文公开的任何一种低聚物化合物，包括至少一部分是核酸的化合物，并且包括例如反义寡核苷酸、包含反义寡核苷酸的分子、sirna和包含sirna的分子。术语反义分子包括例如通常为单链的反义寡核苷酸以及通常为双链的sirna化合物以及shrna分子。反义分子是与rack1 mrna或前mrna转录物的至少一部分互补的反rack1反义分子。79.如本文所用，术语“低聚物化合物”涉及本文所公开的化合物，其包含寡核苷酸，其至少一部分与rack1 rna互补，例如rack1 mrna或rack1 pre-mrna，或其一部分。低聚物化合物可以包含dna、rna或dna/rna的混合物，并且可以包含一个或多个修饰的(即非天然存在的)单体。“低聚物化合物”包括反义寡核苷酸、sirna和shrna结构。低聚物化合物可以包括与rack1 rna互补的部分，但也可以包括额外的一个或多个额外分子、基团或部分(例如细胞穿透部分)。80.如本文所用，术语“反义寡核苷酸”或“aso”是核酸，例如单链核酸，包含核苷酸序列，与rack1 rna的至少一部分互补，例如rack1 mrna或rack1 pre-mrna，包括但不限于混合器、间隙聚合物、尾聚合物、先导剂和阻断剂、吗啉酸、肽核酸(pna)、2'-o-取代反义寡核苷酸(例如2'-o-甲基硫代磷酸酯、2'-o-甲氧乙基硫代磷酸酯)、锁定核酸(lna)等。因此，反义寡核苷酸可以氢键连接到有意义的核酸。例如，反义寡核苷酸可以包含与目标rna结合的dna、rna和/或化学类似物(即修饰碱基)。81.如本文所用，术语“sirna”是指包含与rack1 mrna或前mrna转录物的至少一部分互补的引导链的sirna。82.如本文所用，术语“引导链”是指反义分子的一部分或多条，例如与其靶向结合的rna序列互补的双链sirna。它可以包含天然和/或改性的碱。当提及sirnas时，可以使用“引导链”，当提及反义寡核苷酸和/或其他反义分子时，可以用“部分”。83.如本文所用，术语“shrna构建物”是指包含载体和shdna插入物的构建物，当表达时可以敲低rack1的表达，该载体包括病毒载体，例如慢病毒载体和非病毒载体，其中，shdna可被表达以产生短发夹rna，其包含与rack1 mrna或前mrna转录物的至少一部分互补的引导链。如本文所用，术语“引导链”是指表达的双链shrna的链，其与靶向结合的rna序列互补。84.如本文所用，术语“锁定核酸”或“lna”是指通过引入2'-o，4'-c亚甲基桥将核糖锁定在c3'-内构象中的双环rna类似物。理想的低噪声放大器单体及其合成方法也在美国专利no.6043060、6268490、pct公开wo01/07455、wo 01/200641、wo 98/39352、wo 00/56746、wo 006748和wo 00/66604以及以下文件中公开：morita et al.,bioorg.med.chem.lett.12(1):73-76,2002；hakansson et al.,bioorg.med.chem.lett.11(7):935-938,2001；koshkin et al.,j.org.chem.66(25):8504-8512,2001；kvaerno et al.,j.org.chem.66(16):5498-5503,2001；halkansson et al.,j.org.chem.65(17):5161-5166,2000；kvaerno et al.,j.org.chem.65(17):5167-5176,2000；pfundheller et al.,nucleosides nucleotides 18(9):2017-2030,1999；and kumar et al,bioorg.med.chem.lett.8(16):2219-2222,1998，所有这些都通过引用全部并入本文中。85.术语“混和物”是指包含天然和非天然核苷酸的反义寡核苷酸。然而，与裂殖体、尾端体、首端体和阻断剂不同，没有超过5个自然产生的核苷酸的连续序列。86.本文中使用的术语“gapmer”例如指一种反义寡核苷酸，其中一个内部基于dna的区域(例如“gap”)具有支持rnase h裂解的多个核苷的侧翼是一个或多个基于rna的核苷(例如5'和3'“翼”)，促进目标绑定。在一个非限制性示例中，如表8所述，间隙分子包含dna残基，其两侧为2-moe修饰的rna残基。5'和3'翼可能具有相同的化学修饰，但考虑到5'和3'翼之间的不同修饰以及核苷酸长度的差异。87.本文所用术语“吗啉寡核苷酸”是指包含吗啉单体的非天然寡核苷酸，例如亚甲基吗啉环取代核糖或脱氧核糖部分，非离子磷二酰胺键取代dna和rna的阴离子磷酸盐。例如，靶向内含子元件的反义吗啉寡核苷酸可以调节rna剪接(12)。吗啉寡核苷酸可以是约25个吗啉单体的短链。每个吗啉寡核苷酸都会阻断核糖核酸(rna)碱基配对表面的小区域(约25个碱基)。术语“吗啉单体”是指包含核酸碱、6元吗啉环和非离子磷二酰胺亚单位间连接的亚单位。88.如本文所用，术语“细胞穿透部分”是指介导化合物(例如本文所公开的低聚物化合物)从细胞外空间转移到细胞内的化合物或官能团。89.如本说明书和所附权利要求书所用，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。因此，例如，含有“化合物”的组合物包括两种或多种化合物的混合物。还应指出，除非内容另有明确规定，否则术语“或”通常在其意义上包括“和/或”。90.如本技术和权利要求书中所使用的，“组成”一词及其派生词旨在成为封闭术语，指明所述特征、元素、组件、组、整数和/或步骤的存在，并排除其他未声明的特征、元素、组件、组、整数和/或者步骤的存在。91.本文中端点的数值范围包括该范围内包含的所有数字和分数(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解的是，所有数字及其分数均假定为由术语“大约”修改。92.此处使用的术语“大约”、“实质上”和“约”是指修改后的术语的合理偏差量，以便最终结果不会发生重大变化。这些程度术语应解释为包括至少±5％或至少±10％的修改术语的偏差，前提是该偏差不会否定其修改的单词的含义。93.特定章节中描述的定义和实施例意在适用于本文中描述的其他实施例，如本领域技术人员所理解的，它们适用于这些实施例。94.如本文所示，rack1与突变型fus和sod1共聚集体，其与突变型tdp43可构成这些突变验证内含物毒性的共同途径，例如als。95.本文还证明，在培养细胞中敲除rack1可以减少或抑制fus或tdp43内含物的形成，伴随着缺乏核定位序列的突变蛋白的部分核遣返，这可能是由于去聚集蛋白扩散到细胞核中所致【pinarbasi等人，2018年】。在不希望受到理论约束的情况下，rack1共聚集体中多核糖体的招募可能通过招募具有pfar的60s核糖体亚单位，导致als/ftld相关蛋白错误折叠和繁殖的功能毒性增加。本文描述的数据表明，rack1与突变的tdp-43或fus的共同聚集通过隔离核糖体亚单位抑制全局翻译，并且rack1的sirna敲除可以挽救全局翻译以及60s核糖体pfar可能的病理伴侣活性。96.蛋白聚集体募集的rack1的神经毒性可能是由许多因素引起的，包括正常rack1活性的功能丧失。然而，聚集的rack1功能的毒性增加可能是als和其他tdp-43蛋白病(即tdp-43病)中观察到的蛋白翻译缺陷的原因之一。97.本文还证明，rack1的细胞特异性体内敲除可改善野生型或突变型人类tdp-43转基因过度表达引起的神经变性。98.因此，在一个态样中，提供了一种低聚物化合物，其包含与选自seq id no:1-16、49-51和289-499中任一个的核酸靶序列的至少一部分互补的部分。99.与核酸靶序列的至少一部分互补的低聚物化合物部分的长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一个实施例中，低聚物化合物的长度为14到60个核苷酸。在一个实施例中，寡聚化合物的长度为14到50个核苷酸。在一个实施例中，所述低聚物化合物的长度为14到40个核苷酸。在一个实施例中，低聚物化合物对应于与至少部分目标序列互补的部分，并且包含14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在另一实施例中，低聚物化合物包括与目标序列互补的部分的5'和/或3'方向上的一个或多个额外核苷酸。例如，低聚物化合物可包含该部分上游和下游多达15或20个核苷酸。在一个实施例中，低聚物化合物的长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25核苷酸。100.核酸靶序列可以是表2、3、4或8中的序列或其中任何序列的一部分。在一个实施例中，核酸靶序列与表1中的核酸靶序列不具有相同的序列。在一个具体实施例中。核酸靶序列和表5中的核酸目标序列不具有同样的序列。低聚物化合物可以是或包含表2、3、4或8中任一序列的反向补体或其一部分。101.在一个实施例中，核酸靶序列选自seq id nos：seq id nos：2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-499中的任一个。102.在一个实施例中，核酸靶序列选自seq id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-298中的任一个。103.在一个实施例中，核酸靶序列选自序列id no:2、3、292、297和298中的任一个。104.在一个实施例中，其中该部分是核酸靶序列的补充，并且该核酸靶序列是或包括选自序列id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-499中任一个的序列。105.在一个实施例中，该部分是核酸靶序列的补充，并且核酸靶序列是或包括选自序列id no:2-6、8、10-16、49-51、292-294和296-298中的任意一个的序列。106.在一个实施例中，该部分与核酸靶序列互补，并且核酸靶序列是或包含序列id no:2、3、292、297和298中的任一个。107.在一个实施例中，该部分是对gaactgaaagttatc(序列id no:2)或ctctggatctcgagataaa(序列id no:3)的补充。在优选实施例中，该部分是对gaactgaaagttatc(序列id no:2)的补充。在优选实施例中，该部分是ctctggatctcgagataaa(序列id no:3)的补充。在优选实施例中，该部分是对seq id no:81的补充。在优选实施方案中，该部是对seq id no:86的补充。在优选实施方案中，该部是对seq id no:87的补充。108.低聚物化合物可以是rna或dna或其混合物，可选地包含一个或多个修饰残基。目标是rna。尽管此处的靶点可以表示为dna，但本领域技术人员将认识到，序列中的胸苷(t)被尿嘧啶(u)取代。类似地，尽管低聚物化合物可在此表示为rna，但本领域技术人员将认识到dna化合物包含胸苷(t)而非尿嘧啶(u)。109.反义分子可以使用自然产生的核苷酸和/或各种修饰(非自然产生的)核苷酸进行化学合成，这些核苷酸旨在增加分子的生物稳定性或增加与目标rna或dna形成的双链的物理稳定性。可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代核苷酸等衍生物。修饰核苷酸的其他示例可以包括具有n3′‑p5′氨基磷酸酯、2′‑脱氧-2′‑氟-β-d-阿拉伯糖核酸类似物(fana)、吗啉单体以及在环己烯核酸(cenas)(即dna的呋喃糖部分被环己烯环取代)和三环dna(tcdna)(即包含核苷中心c(3')和c(5')之间的额外乙烯桥的核苷酸，环丙烷单元与之融合)、肽核酸(pna)(即n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元)和/或锁定核酸(lna)中发现的单体。反义分子可以与目标链互补，也可以仅与目标链的一部分互补。110.反义分子可包含至少一种非天然存在的单体，其功能类似于非修饰寡核苷酸。例如，化学修饰可以是在锁定核酸(lna)中发现的化学修饰，也可以是2'-氟(2'-f)、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)或2'-o-甲基(2'-0-me)，它们是核糖部分或吗啉单体2'位置的修饰，其中六元吗啉环取代糖部分或硫代磷酸酯(ps)键，其中硫取代磷酸基团中的一个非桥联氧原子。硫代磷酸酯和氨基磷酸酯键可并入上述任何反义分子中。其他核苷间键包括例如二硫代磷酸酯、甲基膦酸盐、烷基膦酸酯、烷基磷酰硫酯、磷酸三酯、硅氧烷、碳酸盐、碳烷氧基、乙酰胺、氨基甲酸酯、吗啉、硼烷、硫醚、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基膦酸酯、桥联硫代磷酸酯和砜核苷间链。由于诸如在核酸酶存在下增加稳定性等特性，与天然形式相比，这种修饰或取代的核酸可能更受欢迎。该术语还包括包含两个或更多化学上不同区域的嵌合核酸。例如，嵌合核酸可能包含至少一个具有有益性质的修饰核苷酸区域(例如，增加核酸酶抗性，增加对细胞的摄取)，或本发明的两个或多个核酸可结合形成嵌合核酸。111.反义分子可以使用多种方法生产，例如在agrawal s.;gait m.j.(2019).history and development of nucleotide analogues in nucleic acid drugs.advances in nucleic acid therapeutics,(pp 1-21).royal society of chemistry中所述，通过引用并入本文。反义分子或其核酸成分可通过例如以重组质粒、噬菌体或减毒病毒的形式引入细胞的表达载体进行生物制备，其中在高效调控区的控制下产生反义序列，其活性可由引入载体的细胞类型决定。此外，反义分子，例如sirna，可以从制造商那里购买，例如santa cruz biotechnology(美国德克萨斯州达拉斯)。112.在另一实施例中，低聚物化合物包含非修饰rna、dna或dna/rna的混合物。113.在一个实施例中，低聚物化合物包含修饰的rna、dna或dna/rna的混合物。114.在又一实施例中，低聚物化合物包含一个或多个经化学修饰的核苷酸单体。在另一实施例中，化学改性包括在2'位置的改性。在另一实施例中，化学修饰选自2'omethyl(2')-o-me)、2'-o-甲氧基乙基(2'o-moe)、2'氟(2'f)和2'-o，4'-c亚甲基桥，即锁定的核酸id no：7)带5'aa悬垂、ctatctgaacacggtgact(seq id no：8)带5'gg悬垂、cagggatgagaccaactat(seq id no：9)带5'ac悬垂、ccaacagcagcaaccctat(seq id no：10)带5'gc悬垂、ctttgttagtgatgtggtt(seq id no：11)带5'ca悬垂、ccctgggtgtgtgcaaata(seq id no：12)带5'ta悬垂、gctgatggccagactctgt(seq id no：13)带5'ct悬垂、gatttgtgggccataccaa(seq id no：14)带5'gc悬垂、gtaacccagatcgctacta(seq id no：15)带5'gg悬垂、cgcagttcccggacatgat(seq id no：16)带5'cg悬垂、gtacggactaaggtagatt(seq id no：49)带5'ag悬垂、ttttacctcctttagataa(seq id no：50)带5'tg悬垂以及tgttccccaggatttagag(seq id no：51)带5'cc悬垂。在包含悬垂的低聚物化合物中，悬垂可能对应于括号中残基的反向互补，也可能是非目标残基，例如tt，其中小写表示序列是非天然的。129.在另一个实施例中，引导链与gaactgaaagttatc(序列id no:2)互补，具有5'at悬垂，或ctctggatctcgagataaa(序列id no:3)具有5'gt悬垂。在优选实施例中，引导链与gaactgaaagttatc(序列id no:2)互补，具有5'at悬垂。在优选实施例中，引导链是ctctggatctcgagataaa(序列id no:3)的补充，具有5'gt悬垂。130.例如，悬垂可以是a、u、c、g、da、dt、dc、dg以及修饰碱基的任何2核苷酸组合。131.在一个实施例中，sirna是或包含包含序列5'-3'gauaacuucugcuucaguuc(序列id no:18)的引导链。在另一个实施例中，序列为5'-3'uuuaucucgauccagag(序列id no:19)。132.在一个实施例中，sirna是或包含一个引导链，该引导链包含序列5'到3'gauaacuucugcuucaguuc(序列id no:18)，具有3'(au)悬垂(即3'端的额外au核苷酸)。在另一个实施例中，序列为5'-3'uuuaucucgauccagag(序列id no:19)，具有3'(ac)悬垂。133.在另一个实施例中，sirna是或包含一个引导链，该引导链包含一个5'-3'gauaacuucugcuucaguuc序列(序列id no:18)，具有一个3'(au)悬垂和/或uuuaucgauccagag序列(序列idno:19)，具有3'(gu)悬垂。在另一实施例中，序列为5'-3'gauaacuucugcuucaguuc(序列id no:18)，具有3'(au)悬垂。在另一个实施例中，序列为5'-3'uuuaucucgauccagag(序列id no:19)，具有3'(gu)悬垂。134.在一个实施例中，引导链包括具有3'(au)悬垂的gauaacuucugcuucaguuc(序列id no:18)，或具有3'的uuuaucucgauccagag(序列id no:19)悬垂。135.例如，sirna可以是单链或双链。低聚物化合物可以是双链的，例如具有：136.ss 5'-3'gaacugaagcaaguuauc(序列id no:34)，具有3'(au)悬垂，以及137.as 5'-3'gauaacuucugcuucaguuc(序列id no:18)，具有3'(au)悬垂，其中“ss”在这里指义链或副股链，“as”指可作为引导链的反义链。引导链也可以是其一部分或包括额外的残留物。138.sirna可以是双链的，例如：139.ss5'-3'cucuggaucucagauaaa(序列号：35)，带3'(gu)悬垂；和140.as5'-3'uuuaucucgauccagag(序列号：19)，具有3'(gu)悬垂，其中“ss”在这里指的是义链，“as”指的是反义链。141.在一个实施例中，sirna约为21-25个残基且任选地为双链。在一个实施例中，sirna的长度为21个残基。在一个实施例中，sirna的长度为22个残基。在一个实施例中，sirna的长度为23个残基。在一个实施例中，sirna的长度为24个残基。在一个实施例中，sirna的长度为25个残基。142.在一个实施方案中，低聚物化合物是短发夹rna(shrna)。使用sir-2和sir-3的非限制性示例，shrna可以包括例如：143.sir-2 5’‑3’:gaacugaagcaagaaguuauc(seq id no:34)(环)gauaacuucuugcuucaguuc(seq id no:18)；144.sir-3 5’‑3’:cucuggaucucgagauaaa(seq id no:35)(环)uuuaucucgagauccagag(seq id no:35)。145.在一个实施例中，反义分子包含在载体(例如质粒)或病毒载体(例如慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(aav)载体)中。146.在shrna的背景下，环区可以是任何能够形成稳定环的核苷酸组合，通常由5～10nt组成。shrna的末端可以进行化学修饰和/或包含额外的悬垂核苷酸。147.在一些实施例中，目标是本文规定序列的一部分。例如，目标长度可以是19-30个核苷酸。在一些实施例中，与至少部分目标序列互补的低聚物化合物部分包含一个或多个交替核苷酸。例如，该部分可包含化合物3'一半中的一个或多个交替核苷酸，尤其是3'悬垂。例如，已经发现反义sirna的5'端和中间之间的序列负责识别mrna，中间残基(nt 10-11)通常是切割位点识别。148.低聚物化合物可包含细胞穿透部分，包含在运输试剂或载体中，例如表达低聚物化合物的重组质粒或病毒载体。149.在一个实施例中，低聚物化合物包含一个或多个细胞穿透部分。促进细胞内摄取的细胞穿透部分(或细胞附着部分)的非限制性示例包括肽，例如内啡肽、pip’s(pmo/pna内化肽)、糖，例如n-乙酰半乳糖胺(galnac)，抗体，例如fab片段、碳水化合物、脂质例如胆固醇、磷脂、生物素、奋乃静、叶酸、菲啰啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。细胞穿透部分可以操作性地连接或接合到5'端、3'端和/或与目标序列互补的低聚物化合物部分的内部核苷酸。在一个实施例中，细胞穿透部分接合到5'端和/或3'端。在双链sirna的背景下，细胞穿透部分优选连接到过客链，例如在3'末端。低聚物化合物可以使用多种方法耦合到细胞穿透部分。例如，低聚物化合物可以共价连接到该部分，如langel等人的国际专利申请公开号wo2008/063113和troy等人的美国专利申请公开编号us2005/0260756所述。该部分也可以通过化学连接剂连接到低聚物化合物，如wo2008/033285至troy等人和wo2007/069068至alluis等人所述。150.另一方面是包含低聚物化合物或其部分的载体，其与至少部分靶序列互补。例如，低聚物化合物包含在病毒载体中，例如腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒或γ-逆转录病毒载体。该矢量可以是用于提供本构表达式的积分矢量，也可以是用于瞬态表达式的核外矢量。151.另一方面是包含低聚物化合物、任选地抗rack1 sirna、抗rack1-shrna构造或反义寡核苷酸的组合物(例如抗rack1 gapmer或吗啉寡核苷酸)和稀释剂。例如，稀释剂可以是不含核糖核酸酶的水或盐水，也可以是无菌的。152.该组合物可包含脂质颗粒，例如脂质体、纳米粒子、外显体或用于传递反义分子的纳米微脂囊。153.如上所述，反义分子可以包含在载体中。载体例如可以是质粒、细菌或病毒载体，例如慢病毒颗粒或aav。该组合物可包含多个低聚物化合物和/或其他反义分子，例如用于靶向rack1。154.本文所述的组合物可以通过制备药物上可接受的组合物(可选地作为疫苗)的已知方法来制备，以使有效量的活性物质与药物上可接收的载体结合在混合物中。155.药物组合物包括但不限于冻干粉末或含水或非含水无菌注射溶液或悬浮液，其可进一步含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使组合物与预期受体的组织或血液基本兼容。此类组合物中可能存在的其他组分包括水、表面活性剂(例如吐温)、醇、多元醇、甘油和植物油等。即期注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒、片剂或浓缩溶液或悬浮液制备。该组合物可以例如但不限于作为冻干粉末提供，在给受试者之前用无菌水或生理盐水重新配制。156.该组合物可以是药学上可接受的盐的形式，其包括但不限于以游离氨基形成的组合物，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的组合物和以游离羧基形成的组氨酸，例如衍生于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺的组合物，2-乙基阿尼诺乙醇。157.本文所述的组合物、低聚物化合物和载体可例如配制用于鞘内、脑室内、颅内、脊髓内、眶内、眼科、脑实质内、实质内、腹腔内、鼻内、气溶胶或口服。在优选实施方案中，组合物、低聚物化合物和载体被调配用于鞘内给药。158.另一方面还提供了一种治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病的方法，任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)，该方法包括敲除中枢神经系统细胞中的rack1，例如需要该rack1的受试者的神经元和/或星形胶质细胞。159.可以使用反义分子，例如本文所述的低聚物化合物，以rack1mrna和/或pre-mrna为靶点，实现“击倒”。160.另一方面还提供了一种治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病的方法，任选地选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体疾病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)，该方法包括向有需要的受试者投与一个或多个反义分子，例如本文公开的一个或更多低聚物化合物。161.另一方面还提供了一种减少或抑制细胞中tdp-43和/或fus聚集的方法，所述细胞例如包含tdp-43和/或fus聚集的疾病细胞，该方法包括向细胞投与或向细胞中引入一个或多个靶向rack1的反义分子，该反义分子的量和时间足以降低细胞中的rack1水平。在一个实施例中，数量和/或时间足以减少tdp-43聚集和/或部分恢复核tdp-43。在一个实施例中，该量和/或时间足以减少fus聚集和/或部分恢复核fus。162.反义分子，例如本发明的低聚物化合物，可以作为裸反义分子单独施用。如本文所用，“裸”是指不使用运载工具施用反义分子(例如病毒载体)或递送剂(例如脂质体)例如病毒载体、转运试剂。163.在一个实施例中，反义分子通过运输试剂、重组质粒或表达反义分子的病毒载体投与和/或引入细胞。在又一实施例中，通过电穿孔将反义分子引入细胞。164.在另一实施例中，反义分子包含一个或多个细胞穿透部分。在这种情况下，可以单独注射反义分子，即裸体注射，例如鞘内注射，并且依赖反义分子的其他元素，例如化学改性，便于输送到细胞中。在另一实施例中，一个或多个反义分子是反义寡核苷酸、sirna或shrna构造。在另一实施例中，反义分子是一种或多种上述低聚物化合物。165.在其他实施例中，一个或多个反义分子进一步靶向表1中列出的核酸靶序列。166.例如，一个或多个反义分子是本文公开的反义寡核苷酸分子，例如包含或包含seq id no:81、86或87中的任何一个。167.例如，一个或多个反义分子可以是sirna分子，例如包括具有3'tt悬垂的义5′‑ccuuuacacgcuagagagugu(序列id no:501)和具有3'tg靶向cctttacacgcggt(序列id no:75)的反义5′‑accaucuagcguguamgg(序列id no：502)。168.在另一实施例中，通过上述组合物引入一个或多个反义分子。169.在一个实施例中，该细胞是病细胞。在一个实施例中，细胞是中枢神经系统的细胞，例如神经元或星形胶质细胞。在一个实施例中，细胞位于患有tdp43病或fus病的神经变性疾病的受试者中，该疾病的神经变性病例如肌萎缩侧索硬化(als)、额颞叶痴呆(ftld)蛋白病或疾病蛋白与rack1相互作用的蛋白折叠疾病。例如，tdp43疾病是肌萎缩侧索性硬化(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆(ftld)、亨廷顿病(hd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)。在另一实施例中，fus病神经退行性疾病是神经元中间丝包涵体疾病(nifid)或嗜碱性包涵体病(bibd)。170.在另一实施例中，一个或多个反义分子是上述低聚物化合物和/或包含在上述组合物中。在一个实施例中，反义分子和/或组合物与运输试剂一起投与或引入细胞，或作为表达反义分子的重组质粒或病毒载体。运输试剂可以是脂质颗粒，例如脂质体、纳米粒子或纳米微脂囊。在一个实施例中，运输试剂是脂质体。171.在另一实施例中，以合适的肠外或肠内给药途径施用反义分子和/或组合物，包括鼻内、粘膜、口腔、舌下、经皮、局部、吸入、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液或漱口水形式或血管内给药；特别是鞘内、脑室内、脑实质内或脑室内给药；例如导管或其他放置设备，例如使用通过出口导管连接到大脑或脊髓内心室的植入储液罐。172.在其他实施方案中，药物组合物直接投与大脑或中枢神经系统的其他部分。例如，这种方法包括使用植入式导管和泵，通过导管将预先确定的剂量释放到输液部位。本领域技术人员将进一步认识到，可以通过允许导管可视化的外科技术来植入导管，以便将导管放置在大脑中所需的给药或输液位置附近。这些技术在elsberry等人美国专利5814014“通过脑灌注治疗神经退行性疾病的技术”中描述，其通过引用并入本文。还考虑了美国专利申请20060129126中所述的方法(kaplit和during“向患者大脑中注入物质的输液设备和方法”)。向大脑和中枢神经系统其他部分输送药物的设备在市场上可以买到(例如，输液系统；明尼苏达州明尼阿波利斯市medtronic)。173.在另一实施例中，使用诸如修改待施用的化合物以允许受体介导的转运穿过血脑屏障等方法将药物组合物施用到大脑。174.其他实施例考虑将反义分子与已知的生物活性分子共同施用，以促进跨血脑屏障的转运。175.在某些实施例中还设想了用于跨血脑屏障施用本文所述反义分子的方法，例如美国专利7012061“增加血脑屏障通透性的方法”中所述的旨在瞬时增加血脑障碍通透性，本文通过引用并入。176.当给药途径为口服时，药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末、溶液或酏剂的形式。当以片剂形式施用时，药物组合物还可含有固体载体，例如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉末含有约5％到95％的反义分子，优选约25％到90％的反义化合物。当以液体形式施用时，可以添加液体载体，例如水、石油、动物或植物来源的油，例如花生油、矿物油、大豆油、芝麻油或合成油。该药物组合物的液体形式可进一步含有生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式施用时，药物组合物包含约0.5重量％至90％的反义分子或约1重量％至50％的反义化合物。177.如果给药方式为肠外给药、粘膜给药、口服给药、舌下给药、经皮给药、局部给药、吸入给药、鼻内给药、气溶胶给药、眼内给药，气管给药、直肠给药、阴道给药、基因枪给药、皮肤贴片给药或滴眼液或漱口水给药，则反义分子可以是无热原的、肠外可接受的水溶液形式，除反义分子外，含有等渗性载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸林格注射液或本领域已知的其他载体。药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其他添加剂。178.药物组合物中反义分子的数量将取决于正在治疗的病况的性质和严重程度，以及受试者已经历或正在经历的先前和同时治疗的性质。预计用于实施本公开方法的各种药物组合物可包含约1微克至约50毫克反义分子/千克身体/天。根据疾病、疾病的严重程度以及每个个体受试者的状况和潜在的特异性反应，使用本文所公开的药物组合物进行治疗的持续时间将有所不同。179.在另一个实施例中，tdp43病神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)或额颞叶痴呆症(ftld)，或以边缘肌为主的年龄相关tdp-43脑病(late)。在另一实施例中，fus病神经退行性疾病是神经元中间丝包涵体疾病(nifid)或嗜碱性包涵体病(bibd)。180.在另一个实施例中，主体是人类。181.另一方面是使用一种或多种反义分子，例如上述低聚物化合物，例如反义寡核苷酸或sirna分子，和/或方法治疗有需要的受试者的肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)或亨廷顿病(hd)，或减少和/或分解细胞(如患病细胞)中的tdp-43和/或fus。182.另一方面是一个或多个反义分子，例如本文公开的用于治疗tdp43病或fus病神经退行性疾病的低聚物化合物，所述疾病选自肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆症(ftld)、亨廷顿病(hd)、神经元中间丝包涵体病(nifid)、嗜碱性包涵体病(bibd)或边缘型年龄相关性tdp-43脑病(late)。183.在一个实施例中，使用上述反rack1反义分子，包括低聚物化合物，例如反义寡核苷酸、sirna分子和/或组合物，用于制造药物。184.此外，特定章节中描述的定义和实施例意在适用于本文中描述的其他实施例，本领域技术人员可以理解这些定义和实施方式。例如，在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面相结合，除非明确指出相反。特别是，任何被表示为首选或有利的特征都可以与被表示为优选或有利的任何其他特征相结合。scientific)上分离每个转染的10μg蛋白质，转移到pvdf膜上，并在室温下将其封闭在含有5％脱脂奶和0.1％吐温-20的tris缓冲盐水(tbs)中1小时。以下主要抗体在4℃下培养过夜：兔抗ha(abcam，ab9110，1:1000)、小鼠抗rack1(bd biosciences，610178，1:2000)、小鼠抗嘌呤霉素(thermofisher scientific，克隆号12d10，1:10000)，小鼠抗-微管蛋白(蛋白质技术，66031-1-ig，1:20000)。在室温下用tbs/0.1％吐温(tbst)清洗膜3x 10分钟，并持续摇晃，然后是辣根过氧化物酶(hrp)结合的抗鼠或抗兔二级抗体(ge，1:5000)，在室温下孵育30分钟。然后用tbst 3x 10分钟冲洗膜，并用supersignaltm west femto maximum sensitivity substrate(thermofisher scientific)显影。196.结果197.使用本文描述的方法，证明了dnls tdp-43的细胞质聚集诱导rack1聚集和共聚集(图1)，而dnls tdp-43聚集抑制转染细胞中的整体翻译(图8)。进一步证明突变sod1的细胞质聚集诱导rack1聚集和共聚集(图3)。198.结果表明，dnls fus、r495x fus和p525l-fus的细胞质聚集诱导rack1聚集和共聚集(图2)，而dnls-fus转染的单个细胞表现出整体翻译抑制(图7)。还证明核糖体结合缺陷突变体(de-rack1)破坏突变体fus、r495x fus和rack1共聚集(图4)，并部分破坏p525l-fus和rack1共聚合(图5)。进一步证明，突变型fus抑制全局翻译，这可以通过rack1击倒来挽救(图6a、6b和6c)。199.靶向rack1的sirna(rack 1sirna)击倒rack1并减弱细胞质中dnls tdp-43的聚集，并部分恢复核表达(图9)，但不影响空载体转染细胞中内源性核tdp43的表达(图10)。200.rack1 sirna减弱突变型fus、r495x fus(图11)和p525l-fus(见图12)，使其在细胞质中聚集，并部分恢复突变型fes、r495 x fus的核表达(图13)。rack1 sirna不影响空载体转染细胞的内源性核fus表达(图14)。201.dnls tdp-43、rack1和40s(小核糖体亚单位，rps6为标记物)共聚集体(图15)、dnls r495x fus、rack1和40s共聚体(图16)、dnls p525l-fus,rack1和40s共聚体(图17)。此外，dnls tdp-43、rack1和60s(大核糖体亚单位，rpl14为标记物)共聚体(图18)、dnls r495x fus、rack1和60s共聚体(图19)、dnls p525l-fus、rack1和60s共聚体(图20)。202.在rack 1击倒后，“获救”的核dnls tdp-43(图21a和21b)或dnls fus，p25l-fus(图22a和22b)与核糖体亚单位均不相关。dnls tdp-43(图21a和21b)或dnls fus、p525l-fus(图22a和22b)仍然存在于细胞质中，与典型的大聚集体相反，它经常表现出更为弥散的模式，并且仍然与核糖体相互作用。203.dnls fus或tdp 43和rack1共同聚集固碳多核糖体40s和60s亚单位，导致整体翻译抑制(图15-20)。rack1敲除在细胞质中分散dnls fus或tdp-43聚集体，甚至在一定比例的细胞中恢复其核表达，从而从聚集体中释放多核糖体并挽救整体翻译(图21-23)。sunset icc显示，与dnls tdp-43聚集物不同，丝状/弥漫型dnls tdp-43表达细胞显示正常的全局翻译(图8)。该数据表明，敲除rack1有很大潜力使病理性tdp43/fus聚集和翻译机械功能正常化，而不影响内源性核tdp-43，这使得rack1成为als和ftld极有吸引力的治疗靶点。204.实施例2205.使用以下方法设计针对rack1 mrna的sirna。206.步骤1.从五台服务器(如下所示)收集sirna meta预测结果。对于候选sirna的起始位置，将记录5台服务器的基于服务器的预测分数。每个服务器的分数定义都不同，定义如下。207.赛默飞世尔公司的block ittm rnai designer工具：给出的预测质量为零到五颗星(0-5)，间隔为半颗星(链接https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setoption.do？designoption＝s irna)。分数标准化为最大统一分数，间隔0.1。208.sidirect的rnai设计工具：该服务器提供二进制的是/否预测，序列中每个起始位置的得分为1或0(1或0)。(链接：http://sidirect2.rnai.jp/design.cgi)。209.罗切斯特大学医学中心马修斯实验室的oligowalk sirna设计工具：该服务器为给定序列提供了0到1之间的连续概率，使其成为有效的sirna(链接：http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi)。此概率直接转换为分数。210.invivogen的sirna向导设计工具：该服务器将他们的预测分为有效sirna、中等sirna，或者在没有预测的情况下分为无效sirna(链接：https://www.invivogen.com/sirnawizard/design_advanced.php)。这些类别的分数分别转换为1、0.5或0。211.genescript的sirna目标查找器：该服务器为每个预测给出一个非标准化的分数(链接：https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder)。分数值随后通过除以最大预测分数归一化为一。212.步骤2.在标准化后，将五台服务器的分数相加，得到总和s(x)。s(x)是高度可变的站点到站点，即坚固耐用，因为每个碱基对要么被分配一个分数，要么可能为零。为了平滑s(x)的崎岖分布，应用了sigma＝8bp的高斯滤波器，得到平滑的热点分数hs(x)。(图24显示了rack1剪接后外显子mrna的hs(x)，图25显示了前剪接rack1 mrna的8个内含子区域的hs。213.步骤3.hs(x)的峰表示rna序列的区域，预测这些区域可以有效地预测sirna。214.表1提供了已知的sirna/shrna，它们的起始位置在图24中标记为加号。圣克鲁斯sirna是三个序列的混合物，它们从246、631和892开始结合mrna。小写“(aa)”括号中显示的序列不是目标序列，而是当反义分子是sirna时可以合并的悬垂序列。215.表1.已知的sirna/shrna216.mrna起始位置靶序列seq id no242accagggatgagaccaact9.70246(aa)gggatgagaccaactatgg[7][8]71247(shrna)ggatgagaccaactatggaat9.72631(aa)ggtatggaacctggctaac[7][8]73892(aa)gggaaagatcattgtagat[7][8]74784(aa)cctttacacgctagatggt[3]75[0217]表2提供了rack1 mrna的合成sirna。图24将其对应的峰标记为星形标记。[0218]表2.rack1 mrna的合成sirna[0219][0220][0221]表2–续[0222][0223]sirna靶向mrna：在编码区(序列108-1059)内，图24中的其他显著峰包括位置887、909、474、212、646、618、748、779、685、242、584、295、508、988、405、160和178。它们对应的靶向序列列于表3中。序列按高hs(x)到低hs(x)的顺序排列。[0224]表3.rack1 mrna的sirna设计[0225][0226][0227]表3–续[0228][0229][0230]sirna靶向前mrna(剪接阻断sirna)：剪接阻断的sirna设计用于结合rack1前mrna的内含子和外显子区域的边界。热点得分hs(x)的构建方式与mrna相同。提取了extron内含子边界的热点得分，如图25所示。建议的靶序列如表4所示。序列从5'到3'，或从蛋白质翻译的n端到c端。[0231]表4.以rack1前mrna为靶点的sirna[0232][0233]表4–续[0234][0235]阴性对照sirna：为了检验预测方法的有效性，使用低hs(x)评分区域作为阴性对照。表5列出了图24中每个零分区域的中间，图24中零分区域从宽到窄的顺序。[0236]表5.rack1 mrna sirna设计的阴性对照[0237]mrna序列靶序列包括悬垂seq id no100-120(cg)ccgccatgactgagcagat58362-382(ac)cctgcgcctctgggatctc59546-566(ac)tcagagtgggtgtcttgtg60830-850(ag)ccctaaccgctactggctg61[0238]表5–续[0239][0240]结果[0241]sir-2和sir-3sirna序列成功击倒了rack1(图26)。在sirna转染前一天，将hek293t细胞接种到6孔板(thermofisher scientific)上，密度为250000个细胞/孔。根据制造商的指示，使用lipofectamine rnaimax转染试剂(thermofisher scientific)将10μm阴性对照或rack1sirnas导入细胞，以达到每孔25pmol(或每10000个细胞1pmol)的最终浓度。转染后72小时，细胞在2％十二烷基硫酸钠中溶解，然后在30％功率下超声15秒以提取总蛋白。蛋白质浓度通过bca分析(thermofisher scientific)测定。在4-12％nupage sds-page(thermofisher scientific)上分离每个样品中的10μg蛋白质，转移到pvdf膜上，如上所述，对rack1和加载对照α-微管蛋白进行western blotted。使用imagej定量蛋白质印迹带强度。rack1强度归一化为每个通道中相应的α-微管蛋白强度。然后将每个转染的正常化rack1强度与未转染(ut)细胞进行比较。[0242]实例3：敲除rack1可防止体内htdp-43诱导的神经变性[0243]如实施例1所示，在培养细胞中敲除rack1以多种方式改善htdp-43表达引起的表型，包括：减少聚集；恢复核本地化；以及缓解tdp-43诱导的蛋白质合成抑制。为了扩展这些发现，本文进一步证明，在活体内，在活的神经网络中，rack1敲除也可以降低htdp43诱导的毒性。[0244]使用了果蝇表达系统，该系统允许模块化、靶向表达。使用uas-gal4表达系统(rodríguez等人，2012；图27a和27b中解释)，相关等位基因的表达由gmr启动子驱动，从而在很大程度上限制了视网膜神经元的表达，视网膜神经元是一种广泛用于读取神经元变性的细胞群体。使用了人类tdp43等位基因野生型(wt)和als相关点突变(q331k)(elden等人，2010年)。在视网膜神经元中产生了表达htdp43的苍蝇(wt或q331k，有或没有rack1 rnai)(图27b)。[0245]参考图27a，一般来说，一个果蝇系含有一个由特定于所选细胞群体的启动子组成的转基因，该启动子驱动蛋白质gal4的表达。一个单独的稳定果蝇系包含一个带有上游激活序列(uas)的转基因，以驱动感兴趣序列的表达，该序列可能是蛋白质编码或rnai。uas不活跃，这些苍蝇不表达转基因。然而，当这两种苍蝇杂交，产生每个转基因的一个副本的后代时，f1苍蝇只在感兴趣的细胞中产生gal4蛋白，然后与uas结合并激活uas，并开始产生感兴趣的基因/目标(rodríguez等人，2012)。参考图27b，使用在视网膜神经元中表达gal4的gmr-gal4驱动线(从布鲁明顿果蝇库存中心(bdsc)9146号线获得)，并与五条uas线中的一条交叉：[0246]1)uas-htdp43wt(elden et al.,2010；来自bdsc#79587)[0247]2)uas-htdp43q331k(elden et al.,2010；来自bdsc#79590)[0248]3)uas-rack1-rnai(perkins et al.,2015；来自bdsc#60399)[0249]4)1与3重组到同一染色体上[0250]5)2与3重组到同一染色体上[0251]这些杂交产生了在视网膜神经元中表达野生型或突变型htdp43或不表达rack1 rnai的苍蝇。用于制备rnai的短发夹rna具有发夹id#sh047-d12；正向寡核苷酸为caagacactaagctgtggaa(序列id号：76)，反向寡核苷酸为ttccacactctgatggttg(序列id编号：77)。由于每个转基因的亲本系都是杂合的，也有一个带有标记的平衡染色体，因此实验果蝇的兄弟姐妹也会产生，它们只携带驱动因子或未携带的uas转基因。这些苍蝇被用作控制器。[0252]在成年后的前六天(a1至a6)，对每种基因型的苍蝇群进行监测，并每天对视网膜神经元变性进行评分。不同基因型的对照蝇为正常眼形态提供了基线。代表性照片如图28a至28l所示，下面的图29和表6和表7给出了经过统计分析的详细数字。在显示轻度变性的眼睛中，腹缘(箭头所示)往往缺少小眼，而没有变性的眼睛，其腹缘明显完整。此外，还可以观察到死亡的小腹的深色斑点。[0253]如图28a、28e、28i(左列)所示，htdp43wt在a1(图28a)引起轻度神经变性，持续到a6(图28e)，而在对照组中不存在(图28i)。如图28b、28f、28j(第二列)所示，与htdp43wt共表达rack1 rnai的果蝇在a1(图28b)或a6(图28f)没有退化，与对照组没有区别(图28j)。如图28c、28g、28k(第三列)所示，htdp43q331k导致退化，a1处退化轻微(图28c)，但随着时间的推移恶化，导致a6处出现一些轻度(图28g)和一些中度(图28k)病例。当rack1 rnai与htdp43q331k共同表达时，从a1(图28d)到a6(图28h)，退化仍然轻微。图28l是另一个对照，显示rack1 rnai的gmr表达单独不会导致表型。根据li等人发布的系统对苍蝇进行评分，2010：0＝正常；1＝《25％小粒径损失；2＝25-50％小粒径损失；3＝50-75％小腹缺失，伴有小面积坏死(黑斑)；4＝》75％的小腹缺失，伴有大量坏死区域。在每个面板中，右上角的数字表示眼睛收到的分数。[0254]视网膜变性的量化如图29所示。表6显示了苍蝇眼的神经变性得分结果。[0255]表6:苍蝇眼神经变性评分[0256][0257]每天对每个基因型大约50只苍蝇进行评分。对于实验苍蝇，3行表示在a1至a6天每一天得分为0、1或2的苍蝇百分比。100％的gmr》htdp43wt每天得分1，而100％的gmr》htdp3wt rack1 rnai每天得分0。gmr》htdp43q331k苍蝇在a1和a2上都得了1分，但在随后的几天中，越来越多的比例恶化到2分。gmr》htdp43q331k rack1 rnai在a1-a6时均为1分。各对照组在所有年龄段均为0分。如表7所示，卡方检验是作为配对比较进行的，极低的p值表明，所有显示的队列对彼此之间存在显著差异：htdp43wt与对照组不同(第1行)；突变体tdp43与wt(品系3)不同；rack1 rnai的加入对htdp43wt(线路2)和htdp43g331k(线路4)都有显著影响。在图29中，gmr》htdp43q331k(唯一随年龄增长而恶化的基因型)的kaplan-meier曲线显示了在任何一天得分保持在1(而不是下降到2)的苍蝇的百分比。这与gmr》htdp43q331k rack1 rnai相比显示，两者有显著差异(对数秩检验：p＝0.002。误差条为95％置信区间)。[0258]表7:卡方检验[0259][0260]研究发现，所有在视网膜神经元中表达htdp-43wt的苍蝇都表现出轻微的神经变性，重复了已发表的研究结果(elden等人，2010年)。这在a1处很明显(图28a)，在接下来的五天内没有改变(图28e，表6和表7，顶行)。与此形成鲜明对比的是，在所有年龄段共表达rack1 rnai和htdp-43wt的果蝇中，100％的果蝇表现出正常的眼部形态，没有退化(图28b、28f，表6和表7，第二行)。因此，rack1敲除完全挽救了htdp-43wt诱导的变性。突变型htdp-43q331k的表达也导致100％的苍蝇视网膜神经元变性(图28c、28g、28k)。这比htdp-43wt表达引起的情况更严重，并且随着时间的推移也明显恶化(表6和表7，第三行，图29)，从而模拟了疾病的两个特征。相比之下，与htdp-43q331k共表达rack1 rnai的苍蝇表现出轻微的退化，从a1到a6都保持轻微(图2d、2h、表6和表7，第四行，图29)。因此，rack1基因敲除可完全防止htdp-43q331k引起的神经变性随时间的推移而恶化。[0261]实施例4:反义寡核苷酸[0262]产生了反义寡核苷酸(aso)结合人类rack1 mrna，详见表8。对碱基的修改如下。aso在所有碱基之间都有硫代磷酸酯键。2’‑o-甲氧基乙基(2’‑moe)修饰用于每端的5个rna碱基，中间有10个dna碱基以形成“gapmer”结构。指示aso序列与rack1结合的mrna起始位置。虽然aso序列可以表示为dna，但也考虑了胸腺嘧啶(t)为尿嘧啶(u)的rna。[0263]表8:aso序列[0264][0265][0266][0267][0268][0269][0270][0271][0272]实例5：反义寡核苷酸的体外和体内研究[0273]细胞培养[0274]在人类衍生野生型hela细胞中测试实施例4中描述的aso#1至#10。细胞在37℃、5％co2、10％胎牛血清、谷氨酸maxtm-1(2mm)、青霉素(50u/ml)和链霉素(50mg/ml)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中培养。aso治疗前一天，将幼稚细胞接种在12孔板中(corningtmcostartmthermofisher scientific的平底细胞培养板)，密度为75000个细胞/孔，置于1ml培养基中，隔夜培养，达到20-30％的融合率。[0275]aso处理[0276]使用lipofectamine rnaimax转染试剂(thermofisher scientific)以5μl rnaimax/1μm aso的比率将实施例4中描述的250nm、500nm或1μm aso#1至#10引入细胞。细胞与含有aso/rnaimax复合物的新鲜培养基孵育72小时，直到溶解。neurol.21:693-700.[0290]5.lagier-tourenne c.,cleveland d.w.(2009)rethinking als:the fus about tdp-43.cell,136,1001–1004.[0291]6.zhou,zhuan,et al."human rhomboid family-1 suppresses oxygen-independent degradation of hypoxia-inducible factor-1αin breast cancer."cancer research 74.10(2014):2719-2730.[0292]7.kraus,sarah,et al."receptor for activated c kinase 1(rack1)and src regulate the tyrosine phosphorylation and function of the androgen receptor."cancer research 66.22(2006):11047-11054.[0293]8.cao,junxia,et al."rack1 promotes self-renewal and chemoresistance of cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma through stabilizing nanog."theranostics 9.3(2019):811.[0294]9.culver bp,savas jn,park sk,choi jh,zheng s,zeitlin so,yates jr3rd,tanese n.proteomic analysis of wild-type and mutant huntingtin-associated proteins in mouse brains identifies unique interactions and involvement in protein synthesis.j biol chem.2012 jun22；287(26):21599-614.[0295]10.mackenzie iraet al.(2011)distinct pathological subtypes of ftld-fus acta neurologica 121:207-218.[0296]11.ivone g.bruno,wei jin,gilbert j.cote,correction of aberrant fgfr1 alternative rnasplicing through targeting of intronic regulatory elements,human molecular genetics,volume 13,issue 20,15october 2004,pages 2409–2420.[0297]12.elden ac,kim h-j,hart mp,chen-plotkin as,johnson bs,fang x,armakola m,geser f,greene r,lu mm,padmanabhan a,clay d,mccluskey l,elman l,juhr d,gruber pj,rüb u,auburger g,trojanowski jq,lee v m-y,van deerlin vm,bonini nm,gitler ad(2010).ataxin-2intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for als.nature 466(7310):1069–1075.doi:10.1038/nature09320.[0298]li y,raya p,raoc ej,shia c,guoa w,chen x,woodruff eaiii,fushimia k,wua jy(2010).adrosophila model for tdp-43 proteinopathy.pnas 107(7):3169–3174[0299]perkins,l.a.,holderbaum,l.,tao,r.,hu,y.,sopko,r.,mccall,k.,yang-zhou,d.,flockhart,i.,binari,r.,shim,h.s.,miller,a.,housden,a.,foos,m.,randkelv,s.,kelley,c.,namgyal,p.,villalta,c.,liu,l.p.,jiang,x.,huan-huan,q.,wang,x.,fujiyama,a.,toyoda,a.,ayers,k.,blum,a.,czech,b.,neumuller,r.,yan,d.,cavallaro,a.,hibbard,k.,hall,d.,cooley,l.,hannon,g.j.,lehmann,r.,parks,a.,mohr,s.e.,ueda,r.,kondo,s.,ni,j.q.,perrimon,n.(2015).the transgenic rnai project at harvard medical school:resources and validation.genetics 201(3):843‑‑852.[0300]rodríguez adel v,didiano d,desplan c(2012).power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila.nat methods.9(1):47-55.doi:10.1038/nmeth.1800.power.[0301]pinarbasi,e.s.,t.,fung,h.y.j.et al.active nuclear import and passive nuclear export are the primary determinants of tdp-43 localization.sci rep 8,7083(2018).