03 星号活性是随机切割的么？

       虽然星号活性是在典型位点之外的非特异性切割，但从最初对EcoRI的研究中大家就能看出来，星号活性也不是完全随便乱切的，只能叫部分非特异性切割。目前认为，星号活性是限制酶的内在性质，在非最优条件下，几乎所有限制酶都可能产生星号活性。目前研究者只鉴定出少数限制酶的星号识别序列，每种酶产生星号活性的机制也不一定完全相同，相关研究还比较缺乏。在《限制性内切酶在中国》一文中我们提到，中国的结构生物学家在这方面的研究走在世界前列。

04 星号活性受哪些因素影响

        导致星号活性产生的因素有很多，比如限制酶过量、孵育时间过长、反应液中甘油浓度过高（＞5% v/v）、低盐浓度（＜25 mM）、非最佳pH、存在其他有机溶剂、存在除Mg2+之外的二价阳离子等（图2）。

图2 某限制酶星号活性展示 

05 如何控制星号活性

       绝大多数情况下，星号活性对酶切反应都是有害的，因此在实验中，我们应当采取措施避免出现星号活性。一般而言，使用厂家随酶提供的缓冲液，参照厂家说明书给出的反应条件进行实验就不会出现星号活性。但实际酶切反应操作中仍需遵循以下原则：

       ▶  控制酶量和反应体积。限制酶一般贮存在50%甘油中，因此总酶量不应超过反应总体积的10%（例如双酶切总反应体积为20 μl，则两种酶合计加入的体积不应超过2 μl）。反应液体积不宜过小，以免反应过程中水分蒸发提高甘油浓度。

       ▶  选择能完全切割所需的最短时间，过长反应时间可能会引起星号活性。

       ▶  使用推荐的缓冲液，不同离子强度和pH值的缓冲液可能会引起星号活性。

       ▶  确保反应体系中不含其他有机溶剂，如制备DNA过程中可能会混有的乙醇。

       ▶  反应液中注意不要含有Mg2+之外的二价阳离子，其它二价阳离子不适合限制酶的活性位点，会对其正确识别造成干扰。

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