CTAB法提取DNA的原理、步骤及注意事项 |
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森言森语 今天是今年第一次提DNA，不知道为什么，今天加完异丙醇之后直接出现了大量肉眼可见的絮状沉淀（DNA），神奇的是之前太多次提DNA从来没有在这一步出现如此大量的絮状沉淀，往往是在加完异丙醇在-20℃预冷沉淀，离心之后才有肉眼可见的絮状沉淀。然后下午继续后面的无脑步骤时，不禁再次问自己，提DNA的原理到底是什么？提RNA的原理又是什么？之间的联系和区别又在哪里？说实话，让我一板一眼的说DNA提取的原理，我还真说不上来，有点扎心。既然我说不清楚，那就很有必要查一查，重新学习一下。其实我很好奇，如果毕业答辩的时候被老师提问了这个问题，几人能说清楚，哈哈……注意事项： 实验室常用试剂几乎都有毒，尤其DNA提取过程中涉及到的试剂也有很强毒性，接触后会对身体造成不同程度的影响和伤害，长期操作不规范将对身体造成极大的安全威胁。因此，为了自己和他人的生命安全和身体健康，以下所有步骤均应在佩戴后口罩和手套后，在通风橱操作。DNA提取的要求：
保证结构的完整性；
尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；
保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
提取步骤及原理： 主要提一下CTAB法提取植物基因组DNA原理。 1 将植物组织置于2 mL离心管，加入2颗灭菌钢珠，液氮冷冻，球磨仪研碎；2 加入800 μL CTAB提取缓冲液，65℃水浴1 h，期间每隔15 min颠倒混匀若干次；说明：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 Tris-HCl 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA 抑制DNase活性。 NaCl 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚、糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。 3 加入800 μL苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上层水相转移至新的2 mL离心管； 说明：苯酚：从水相中抽提变性的蛋白质，抑制DNase的降解作用；氯仿：加速有机相和水相分层，去除残留酚；异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的起泡。4 加入等体积氯仿：异丙醇（24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上清转移至新的1.5 mL离心管；说明：原理同上一步，抽提更彻底。 5 加入0.6倍体积异丙醇，-20℃沉淀30 min以上；说明：异丙醇用来沉淀DNA，沉淀所需体积小，但难挥发。 6 12000 rpm离心10 min，弃去上清，加入75%乙醇洗涤两次；说明：其实乙醇也可用于DNA的沉淀，其虽易挥发，但所需体积大，因此普遍使用异丙醇沉淀，然后用乙醇洗涤除去残留的异丙醇。另外，DNA不溶于乙醇，但CTAB和一些蛋白质可溶，低温乙醇还可抑制DNase活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。 7 真空干燥仪干燥40 min左右，加水溶解DNA。 本文使用 文章同步助手 同步 |
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