Journal: Microbiome

Published online 2020 Jun 30

Link:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7329523/

摘要

文章基于2019年3月6日在奥地利举行的研讨会框架中的讨论。

根据1988年Whipps等人提供的简短、清晰和全面的描述，提出了微生物组的定义，并根据最新的技术发展和研究成果，对其进行了一系列新颖的建议。

明确区分了微生物组（microbiome）和微生物群（microbiota）的术语，并提供了一个全面的讨论，考虑微生物群的组成，微生物群的异质性和时间和空间动态，微生物网络的稳定性和弹性，核心微生物群的定义，以及功能相关的关键物种。

从微生物（microorganisms）到微生物组（microbiome）:历史概述

文字内容略。

定义微生物组：当前的定义和不足

微生物群落通常被定义为生活在一起的微生物的集合。更具体地说，微生物群落被定义为多物种组合，微生物有机体在一个连续的环境中相互作用。

1988年，Whipps首次给出了微生物组这个术语的定义。他们把“微生物组”描述为“micro微”和“biome生物组”两个词的组合，并把“在一个合理定义的栖息地中具有独特的理化性质”的“特征微生物群落”称为它们的“活动场所”。这一定义代表了微生物群落定义的实质性进展，因为它定义了具有独特特性和功能的微生物群落及其与环境的相互作用，导致特定生态位的形成。然而还有许多其他的微生物组定义（如基于生态的定义，生物/宿主驱动的定义，基因/方法驱动的定义，混合定义等等，具体见原文）。

这些定义意味着宏观生态学的一般概念可以很容易地应用于微生物与微生物以及微生物与宿主的相互作用。然而，这些从宏观真核生物发展而来的概念，在多大程度上适用于休眠、表型变异和水平基因转移等生活方式不同的原核生物以及微真核生物，尚不十分清楚。

这提出了一个全新的微生物群落生态学概念模型和理论的挑战，特别是在微生物相互作用的不同层次，宿主生物，及非生物环境。当前的许多定义未能捕捉到这种复杂性，并将术语微生物组描述为只包含微生物的基因组。

修订后的概念框架将允许我们从分类微生物转向对微生物的功能及其与环境的相互作用的更全面的观点。修正包括(1)微生物组的成员,(2)微生物组的成员之间的相互作用和微生物网络,(3) 微生物时空特征,(4)核心微生物群,(5) 从功能预测到物种的表型,(6)微生物-宿主或环境互做和共同进化。下面将详细讨论这些方面。

1. 微生物组的成员

微生物群（microbiota ）包括形成微生物组的所有活的成员。

细菌、古菌、真菌、藻类和小型原生生物应被视为微生物组的成员。

而噬菌体、病毒、质粒和可移动遗传元件的整合是微生物组定义中最具争议的观点之一。

关于从死细胞中提取的细胞外DNA(relic DNA)是否属于微生物组，也没有明确的共识。这种遗迹DNA可占土壤中已测序DNA的40%，在更广泛的栖息地分析中，遗迹DNA平均可占细菌总DNA的33%，其中在一些样品中最高比例为80%。尽管遗迹DNA无所不在且数量丰富，但它对分类和系统发育多样性的估计影响极小。

微生物群（microbiota ）通常被定义为存在于特定环境中的活的微生物的集合。

噬菌体、病毒、质粒、朊病毒、类病毒和游离DNA通常不被认为是活微生物，它们不属于微生物群。但是他们属于微生物组。

微生物组这个术语有时也会与宏基因组混淆。然而宏基因组被明确定义为来自微生物成员的基因组和基因的集合。

目前的物种定义是基于生物之间的DNA同源性，比如DNA-DNA杂交超过70%的DNA相似性，或者是平均核苷酸相似度。与真核生物相似，微生物菌株或生态型是分类和功能的基础。

由于水平基因转移(HGT)的频繁发生，确定的菌株的稳定性是最关键的问题。后者是由质粒、噬菌体、转座子等可移动遗传元件从一个菌株转移到另一个菌株，导致不可避免的基因组改变，强烈影响菌株的稳定性。

关于70%DNA杂交的历史，我之前写过：

97%阈值的历史

2. 微生物网络与相互作用

微生物之间相互作用对微生物的适应度、种群动态和菌群内的功能产生不同的结果。相互作用既可以发生在同一物种的微生物之间，也可以发生在不同物种、属、科和生命领域之间。

次生代谢物在介导复杂的物种间相互作用和确保在竞争环境中生存方面发挥着重要作用。群体感应(QS)是由n-酰基-高丝氨酸内酯或多肽等小分子诱导的，可以使细菌控制协同活性，使其表型适应生物环境，从而导致细胞-细胞粘附或生物膜形成。在大多数厌氧生态系统中，物种间直接电子传递(DIET)是一种重要的通讯机制。此外，挥发性化合物可以作为长距离跨领域通信的长期信使。此外，所谓的“真菌公路fungal highways”既是细菌的运输系统，也是水和营养物质的运输系统，因此在构建微生物网络中可以发挥重要作用。

这些相互作用模式可能是正面的(互利、协同或偏利)、负面的(捕食、寄生、拮抗或竞争)或中性的。微生物的生命策略概念可以影响相互作用的结果。复杂微生物生态系统的稳定性取决于同一底物在不同浓度下的营养相互作用。

生物信息网络和共现分析提供了有关微生物相互作用模式复杂性的观点，但它们不适合阐明这些相互作用的性质。尽管存在这种局限性，微生物网络的分析使研究人员能够识别中心物种，并探索微生物群系内不同类型物种相互作用的潜力。

共现分析也可应用于不同的尺度，如群落尺度上的生态系统间共现模式、群落内共现微生物的模块、嵌套在微生物群落内的模块内的共现对。它们可能与定殖抗性有关，定殖抗性决定了外来微生物入侵本地群落的可能性。

微生物间的相互作用是微生物群落内进化和协同进化动力学的重要基础。微生物群落成员之间的交流产生了一种复杂的格局，在这种格局中，细胞的适应性或功能不仅取决于单个细胞的遗传潜力和化学环境，还取决于所感知的生物环境。

网络中的枢纽物种通常被假设为关键物种，这一概念已从宏观生态学转移到微生物组研究。研究表明与其他物种相比，关键物种在不同物种间的相互作用中发挥关键作用，对生态系统的性能和动态具有更大的影响。然而，在一个联合网络中的枢纽物种不一定扮演一个关键物种的角色。Hub和keystone分类群确实需要更好地了解它们在原位的功能。

微生物相互作用可视化通过微生物共现网络。微生物间的相互作用受环境因素的影响，可分为正相互作用、中性相互作用和负相互作用。微生物共现和共排斥网络有助于可视化微生物相互作用。在这样的网络中，节点通常代表微生物类群，而边缘则代表节点之间具有统计意义的关联。绿色边缘通常为正相互作用，而红色边缘则为微生物之间的负相互作用。相关模型系统的网络分析所产生的假设进行检验是全面研究微生物相互作用的必要条件。

3.考虑微生物群的时空变化

微生物组内的时间动态可以从秒或分钟的尺度进行评估，反映信使RNA的时间跨度到数百年或数千年的尺度，在此期间微生物与宿主或在特定环境中协同进化。细菌mRNA的半衰期取决于转录的基因，但通常在分钟范围内，而来自古菌基因的转录则更长，有报道称其半衰期长达数小时。

尽管过去许多作者将微生物活性与rRNA含量联系起来，但最近的研究表明这一概念存在严重的局限性，只有mRNA可以被认为是代谢状态的可靠指标。

Stegen建议考虑三类因素作为影响微生物群落时间动态的因素:(i)生物和非生物历史;(ii)内部动态;(iii)外部强迫因素。

大多数自然生态系统具有高度的空间结构特征，这被认为对许多生态系统服务具有重要意义。考虑空间尺度可能意味着比较遥远地区之间的微生物模式，以及同一生境存在不太明显的区别。

土壤主要由微观团聚体(< 0.25 mm)和宏观团聚体(0.25至2 mm)组成，微观团聚体结合土壤有机碳，使其免受侵蚀，宏观团聚体限制氧气扩散并调节水流;每种聚集体都提供了独特的生态位，具有其特有的微生物组结构。

有人提出，土壤是地球上微生物群组成最多样化的生态系统，这是在小空间尺度上存在很多的不同生态位的结果。例如，农业耕作方式导致的生态位减少可能导致微生物多样性的损失。由于植物和耕作在很大程度上影响着土壤结构的发展，植物多样性的丧失也强烈影响着土壤微生物群落的生物多样性。然而，“有鸡还是有蛋”这个问题的答案(土壤微生物群的变化是导致了植物多样性的变化，还是相反?)仍然不清楚。

近年来，种子微生物区系作为核心微生物区系从一株植物世代向另一株植物世代垂直传播的可能方式而受到关注。与植物相似，人体的微生物定植也不是单一的:每个身体部位都有自己的微生物群，甚至一个身体部位的微生物群也可能因取样区域的不同而有所不同(如皮肤微生物群)。

微生物热点地区和热点时刻通常是紧密相连的。例如，土壤的特征是存在所谓的微生物热点区域(空间分离，包括根际、旱作层或碎屑层)和热点时间(时间动力学)。在热点地区，活跃代谢微生物的比例是非热点地区的2-20倍，这使得与微生物活性较低的地区相比，热点地区微生物群落结构和功能的时间变化更具动态性。

热点地区可参见之前文章：

SBB-土壤微生物hotspots:概念&综述

微生物群落在时间和空间上的动态。

4.定义核心微生物群

基于共发生分析和微生物群落时空动态的实验数据，可定义一个核心微生物群。确定核心微生物群可以促进对微生物群中稳定和永久成员的区分，而这些群体可能是间歇性的，只与特定的微生物群状态有关，或局限于特定的环境条件。

第一个建议是由Shade和Handelsman提出，他们将核心微生物组定义为来自相似栖息地的微生物群落之间共有的成员，以在复杂的微生物组合中识别稳定、一致的成分。目前，核心微生物区系的定义大多是基于DNA序列和分类学信息。

考虑到基于在DNA的分析(主要是标记基因的扩增子测序)的分辨率限制，很明显核心微生物群落主要是通过种群的属水平来定义的，而没有考虑到菌株水平和功能变异。

相比之下，Lemanceau等人提出了一个功能核心微生物群，其中包括携带复制因子(基因)的微生物载体，这些微生物载体具有对整体适应度至关重要的功能。

微生物群随着时间的推移而改变，这取决于环境条件、营养的可用性和/或生长和健康阶段，甚至宿主的昼夜节律。相比之下，“核心”微生物群似乎保持相当稳定。

从功能预测到表现型

宿主-微生物共同进化

宿主与其相关微生物之间的密切关系产生了宿主及其相关微生物群共同进化理论。

一个例子是早期陆生植物的建立得到了共生真菌的促进，这表明自从微生物第一次出现在陆地上，植物就与微生物共同进化。另一个例子是真核生物本身;线粒体和质粒是真核细胞中的细胞器，它们是从共生细菌中衍生出来的，在整个共同进化过程中，它们完全依赖于宿主，反之亦然。

根据微生物与宿主的相互作用，将微生物划分为有益的、致病性的和中性的。

近期对条件致病菌的研究表明，宿主与微生物的相互作用不仅取决于宿主本身，还取决于整个微生物组。

微生物与宿主相互作用的另一个有趣解释是所谓的“安娜·卡列尼娜原理”。其与列夫·托尔斯泰的名言“所有幸福的家庭都是相似的;每个不幸的家庭各有各的不幸”相似。与健康的个体相比，营养不良的个体在微生物群落组成方面的差异更大。

这个概念之前介绍过，参见：

Nature microbiology：微生物群落的安娜·卡列尼娜原则

宿主与其相关菌群之间的共同进化可以相应地被描述为拮抗或互惠。最近共进化理论转向了整体方法。整体方法将宿主及其相关的微生物群视为一个整体，它们共同进化为一个实体。

微生物组研究技术标准

DNA提取和处理程序在随后的微生物分析中会带来偏差。使用已定义的模拟群落（ mock community）一方面可以帮助确定可能的最佳提取方法，另一方面可以作为一种内部控制来估计整个工作流和分析过程中可能存在的偏差。然而模拟群落并不能解决所有问题，这给环境样本中微生物的分析带来了偏差。

此外，在土壤等复杂环境中提取的DNA中，残留DNA(来自死亡细胞的细胞外DNA以及活细胞的排泄DNA) 可能高达80%。这些残留DNA可增加多样性，并导致对分类单元相对丰度的不准确估计。

Nocker等人提出了一种可能的解决方案，他们使用了可穿透膜损伤细胞的popidium monoazide (PMA)，其中光诱导叠氮基团与DNA共价结合。这种交联有效地抑制了革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死亡细胞DNA的PCR扩增。该方法已成功应用于微生物组研究，特别是那些微生物丰度和活性较低的研究，但尚未成为标准。

Karst开发的无引物rRNA基因测序方法促进了微生物多样性的发现。作者建议将poly(A)尾与和SSU rRNA分子逆转录结合成长读长测序。利用这种方法，他们能够高产出高质量的、全长的SSU rRNA序列，没有引物偏差，并且在他们的研究中观察到很大一部分至今未描述的多样性。

ASVs在可重用性、可重复性和全面性方面都有很大的改进，因此ASVs可以取代OTUs成为标记基因分析和报告的标准单位。一些研究和联合项目对不同的工具和管道进行了比较，结果显示根据工具或管道以及所使用的参数，结果有显著差异。除了足够的测序深度，注释数据库的选择对结果也有很大的影响。

稀有类群往往被忽略。这种罕见的类群占微生物总数的28%，在某些生境中扮演着重要角色，可能对构建群落具有重要意义。它们可能在生物地球化学循环中扮演着过度比例的角色，并且可能是微生物组功能的一个隐藏的驱动者。

计算资源仍然是生物信息学研究的瓶颈。例如TARA Oceans微生物组项目的原核生物分类包括135个样本。对于这些样本的分析，需要248次运行，包含288亿次读取，分析输出约10 TB的数据。

微生物研究的未来展望和挑战

随着组学技术的进步，微生物组数据的可用性不断增加，我们对微生物群提高生产力和多样性系统可持续性的潜力的理解急剧增加。应用微生物组研究的宏伟愿景是改善人类、动物、植物和整个生态系统的健康。

一般而言，微生物群落的管理可以直接通过(i)微生物组移植，(ii)具有有益特性的微生物， (iii)微生物活性代谢物进行，或通过改变环境条件间接进行。

当比较基于微生物的人类、动物和种植系统的应用时，可以看到显著的协同作用。虽然各个领域之间的联系还不是很好，但在所有领域都出现了一种明显的一致趋势。

即并非所有个体宿主及其相关的本地微生物群落对特定引入的微生物、微生物组移植或代谢物的反应都是相同的。相反，它依赖于对那些特定的寄主-微生物、环境-微生物以及微生物-微生物相互作用的基本理解，这些相互作用介导了微生物组在不同环境中的组合和功能能力。

人体微生物组正在成为个体化药物的关键靶点。粪便菌群移植是美国批准的治疗难治性梭状芽孢杆菌复发感染的方法。尽管其功效背后的机制仍不为人所知，但近年来其应用范围迅速扩展到胃肠道疾病以外的多个领域，如肥胖症、代谢综合征和肝脏疾病的潜在疗法。人类之间以及跨越时空梯度的微生物异质性需要多维数据集和一套统一的理论和统计工具来分析人体微生物组，并充分发挥微生物治疗的潜力。总的来说，最近所述的肠-脑、肠-肝和肠-肺轴也强调了健康肠道菌群的重要性，使肠道成为人类健康的中枢器官。

植物微生物组被确定为下一次绿色革命的关键。一种将植物育种、精细耕作、农业管理和微生物组研究相结合的系统方法，为在不断变化的世界中提高可持续的作物生产提供了一种强有力的策略。

特定物种和生境的植物微生物群对植物的功能起着多方面的作用，如(i)种子萌发和生长，(ii)营养供应，(iii)对生物和非生物胁迫因子的抗性，(iv)产生生物活性代谢物。由于植物微生物对作物健康的重要性，人们对其进行了长期的研究。此外，还制定了一份广泛的微生物组管理策略和产品清单，其中包括i)微生物组移植(秸秆粪便和生物动力学添加剂)，(ii)微生物接种剂，(iii)微生物和植物提取物，(iv)改变环境条件的方法。

与人类肠道菌群相似，种子/根际菌群对植物至关重要，种子是下一代微生物的完美目标。

Perez-Jaramillo提出了针对种子的“回归根部”方法，利用农作物野生亲缘的种子微生物群落，或利用有前途的生物资源，有可能使植物与其特定的种子微生物群之间形成匹配的共生关系。收获后的微生物群与我们的食品微生物群密切相关，这些微生物群也可以被管理为所需的食品功能特性、安全和保存问题、感官或健康特性。

结论

基于该领域最近的进展，建议恢复由Whipps等人提出的微生物组术语的最初定义。这个定义包含了在1988年出版后30年仍然有效的所有重要要点，并通过两句解释性的句子加以扩展，区分术语微生物组和微生物群，并阐明其动态特性。

微生物组被定义为一个具有独特的物理化学性质的特征微生物群落，它占据一个合理的明确定义的栖息地。微生物组不仅是指所涉及的微生物，还包括它们的活动场所，从而形成特定的生态位。微生物组是包括真核宿主在内的宏观生态系统的一部分，它形成了一个动态的、相互作用的微生态系统，易于随时间和规模变化，对真核宿主的功能和健康至关重要。

微生物群是由属于不同生物界的微生物组合而成的(原核生物[细菌，古菌]，真核生物[原生动物，真菌，藻类])。而“它们的活动场所”包括微生物结构、代谢物、可移动的遗传元素(例如转座子、噬菌体和病毒)，以及嵌入在栖息地环境条件中的残留物DNA。

此外，作者认为以下几点对微生物组研究至关重要:

1.核心微生物群是一组来自相似栖息地的微生物群落共享的成员，这对于理解复杂微生物组合的稳定性、可塑性和功能非常重要。

2.适应于宏观生态学的理论可能有助于理解不同环境下的微生物群落动力学模式，但它们的普遍应用还有待验证。

3.适当的实验、方法和统计设计是每个微生物组研究的基础。空间、时间和发展应该在设计中实现集成(i)选择合适的采样频率,以获取完整的核心和瞬态微生物群,(ii)考虑适当的空间系统的规模,和(3)强烈的动态系统,调查微生物分布的时空连续体。

4.微生物组的研究受到方法学进步的强烈推动。尽管在这一领域取得了所有进展，但没有一种完美和普遍的方法。一个技术工具箱将减少由单个技术产生的偏见，并使生物系统作为一个整体得到更完整的研究。

5.微生物在生态系统中起着重要的作用。建议在微生物组研究中结合几种目前可用的方法，以便更深入地了解微生物的功能。

6.尽管在过去的十年中产生了大量的组学数据，我们仍然缺乏关于生物体背后的信息。因此需要大力实施更多以培养为基础的方法来进行微生物组研究，从而能够描述特定微生物群对其环境的生态型和适应模式。

7.微生物相互作用是微生物群落功能和进化动力学的基础。因此提倡在研究设计中考虑交互作用。

8.宿主与微生物的相互作用形成了互惠的适应度、表型和代谢，从而提出了微生物群及其宿主共同进化的理论。建议一种基于全基因组进化理论的整体方法。

9.根据微生物与宿主的相互作用，将微生物分为有益微生物、致病微生物和中性微生物是基于人类中心的观点。事实上，宿主和整个微生物组的生理机能在很大程度上影响着相互作用的结果。