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导读
细菌可以通过水平基因转移（HGT）获取外界DNA，这一机制可以使该生物快速适应环境变化，为该生物提供竞争优势并可能改变它跟宿主之间的关系。尽管实验室经常利用HGT原理进行相关实验，但我们从实验室实验中了解到的信息与我们从自然环境（例如人类肠道微生物组）中了解到的信息之间存在很大的脱节。归功于目前新的计算算法和实验方法的发展，我们对正在进行的HGT有了更广泛的认识，并开始研究自然微生物群落中HGT的生态学意义。这篇综述聚焦HGT分析技术，讨论它们能够解决的问题及目前受到的限制。随着这些方法得到更广泛的应用，我们开始认识到微生物组中HGT可能的全貌和间歇的动态，特别是对外界刺激所做出的反应。此外，我们更好地描述了可移动基因元件（MGEs）受到的复杂选择压力以及它们与细菌宿主基因组相互作用的机制。
论文ID 原名：Examining horizontal gene transfer in microbial communities 译名：微生物群落中的水平基因转移分析 期刊：Nature Reviews Microbiology IF：60.633 发表时间：2021.4.12 通讯作者：Ilana Lauren Brito 通讯作者单位：美国康奈尔大学生物医学工程系 综述框架 
主要内容 1 概述细菌通过水平基因转移（HGT）获得新的外界DNA，这使它们能够适应不断变化的环境条件。这一外源DNA（指在细菌间水平转移的DNA）可能含有能够扩充细菌生境范围、改变细菌与宿主的关系或提供与环境中其他生物竞争的优势的元件。最值得注意的是，携带抗生素耐药基因的DNA元件转移可能造成对一线抗生素治疗耐药的感染。可移动基因元件（MGEs）转移的功能除了耐药性，还包括消化多种糖类、汞抗性、毒力改变和用于生物修复的分解代谢等。尽管确定菌株之间的表型差异很重要，但令人惊讶的是，人们对自然微生物群落中HGT的内容、时间和方式知之甚少，这在很大程度上是由于原位检测可移动基因库时存在技术上的困难。总的来说，这种外源DNA（即可移动DNA）被称为“可移动基因组”，可以为生物适应和物种形成过程提供生态学上的理解。尽管通过16S rRNA测序方法分析微生物群落在推断细菌群落功能差异方面已变得司空见惯，但这种方法忽略了作为表型变异来源的可移动基因。实际上，生物体基因组的一半都可能包含可移动基因，大量研究案例证明基于水平获得性状的菌株异质性可以彻底改变自然生态系统，例如，编码霍乱毒素的噬菌体CTXφ对霍乱弧菌产毒菌株产生的影响和将编码基因毒素的整合结合元件引入与结直肠癌相关的肠杆菌中。鉴于有用途更广的工具可以以前所未有的分辨率和广度检测HGT，要确定HGT对天然微生物群落功能的影响程度似乎开始变得容易起来。DNA可以通过多种方式进行转移，其中接合、转座和转化被研究得最多，而其他的方式也逐渐被发现，如外膜囊泡获取和通过病毒样颗粒转移等（图1）。参与到这一过程的DNA具有异质性和动态性。病毒基因组可以包装在噬菌体病毒粒子中，溶原性噬菌体可以整合到基因组中；质粒可以保留为染色体外环化DNA或线性化DNA，也可以整合到基因组中；转座子可以出现在基因组或质粒或噬菌体中。尽管外源DNA可以帮助区分基因组种水平或垂直获得的基因，但要完整分析这种DNA需要各种基因组技术的组合。
图1. 自然群落中水平基因转移的一般方式。a.转化通过从环境中裂解细胞摄取裸露DNA。b.在转导过程中，噬菌体的遗传物质整合至细菌基因组。c.接合是通过接合菌毛转移DNA的过程，是DNA在细菌间转移的主要机制。d.外膜囊泡获取和通过病毒样颗粒转移等其他机制。 实验室HGT研究开始于20世纪40年代Joshua Lederberg和Oswald Avery的开创性工作，从那时起诱导细菌整合DNA已被用于各种生物。这类试管实验在研究HGT的发生率和普通触发因素时特别有用，然而，我们虽然可以通过电穿孔或化学诱导HGT发生，但是对自然群落中的HGT情况知之甚少。这方面研究刚开始时使用质粒报告基因，例如研究生物膜中HGT现象，为更广泛地研究HGT发生率奠定了基础。并且，现在这种方法重新被应用于联合下一代测序分析微生物组中的HGT情况。同样，随着可用基因组数量的指数增长，检测基因组中HGT标志物的方法也得到了进一步发展。因为研究古老基因转移事件的方法可能有所不同，本综述主要关注近期HGT的研究方法（表1）。尽管如此，许多研究古老HGT事情的方法已经成熟，并且对检测近期HGT也很有效。由于该领域正迅速出现的新技术可能尚未经过全面审查，因此使用多种方法对结果进行交叉验证并使用数据库或基于实验室培养的方法结果进行确认，对于确定其中准确又可靠的方法的至关重要。 表1. 自然微生物群落中水平基因转移研究方法的目的、优势和局限性。
这篇综述的一个主要目标是对跨学科的研究进展进行整合。关于HGT的许多基本问题在不同的生态系统中都一样：哪些基因最常被转移？在哪些细菌之间进行转移？通过什么方式发生的？发生的条件是什么？有什么障碍？又是以什么速度进行转移？这篇综述中提到的方法都是普遍适用的，只需要针对不同的微生物群落特征进行微调，比如，它们是否被稀释，是否存在重颗粒物，是否存在难以裂解的革兰阳性物种，是否存在PCR反应的抑制剂等。不同环境的MGEs具有不同的GC含量百分比、k-mer组成和基因内容。例如，与携带抗生素抗性基因的质粒相比，携带杀虫剂抗性或金属抗性基因的质粒往往更大，更有可能携带毒素-抗毒素系统，这可能反映了不同环境中的潜在选择压力。如果有更好的基因转移分析方法，我们很快就能回答以下问题：HGT在微生物群落的弹性和适应性方面的作用是什么？转移基因和细菌宿主基因之间的串扰是例外还是规则？基因转移通常为微生物受体带来有益或有害的结果？HGT对物种形成和整个微生物群落进化的相对贡献是什么？ 2
宏基因组中的可移动基因元件鸟枪法宏基因组测序可以捕获部分MGEs，但是短读长序列（Illumina平台为100-300 bp）对于水平转移基因区域的组装和识别具有一定困难（图2a）。原因有以下几点：MGEs经常包含过多的基因成分并且存在于多种基因组中；在同一个基因组中，它们可能跟其他MGEs进行重排；MGEs两侧可能存在重复序列或反向重复序列（图2b,c）。而且，跟宿主基因组相比，由于噬菌体、高拷贝质粒和普通可移动基因的存在，组装工具还面临着MGEs的不同测序深度的难题（图2d）。宏基因组组装工具，尤其是那些利用de Bruijn graph组装的工具，在面对复杂的graph时会产生碎片化的重叠群。在MGEs中存在一些一致的特征或标志可用于识别MGEs，比如参与HGT过程中的机械蛋白（如分解酶）、酶和结构蛋白（如噬菌体衣壳蛋白）等。具体来说，这些标志物包括组装成噬菌体的蛋白质（例如，噬菌体衣壳和尾部蛋白），参与接合的蛋白质（例如，在转移起点切割DNA以诱导转移的质粒松弛酶或Tra基因）和转座酶和插入序列。原始的reads或组装的contigs可以跟MGEs数据库进行比对，但这些数据库可能不适用于所有样本。联合检测方法往往结合注释信息和基因特征，例如GC含量、甲基化模式、k-mer内容或识别环状质粒基因的能力等的差异。由于许多样本独特的遗传多样性可能来自MGEs，因此当使用基于参考序列的比对方法时，可能会忽略大部分移动基因库。在一项对斐济岛民肠道微生物群落的研究中，观察到的移动基因与现有参考基因组中鉴定的MGEs比对的完整程度远低于包括受调查斐济人口的细菌基因组中鉴定的MGEs的数据集。总体而言，MGEs的参考数据库并不完整，并且大部分都来源于被充分研究的病原生物。尽管正在用计算方法来了解噬菌体在宿主之间的移动，但它们的多样性实在太广泛。最终，当前既没有可以用于比对的综合性MGEs参考数据库，由于MGEs进化速度太快这种数据库也不太容易建立起来。因此开发在保留基因内容和基因组背景的前提下识别宏基因组短序列中的MGEs又计算成本不高的方法成为了迫切需求。 
 图2. 可移动基因组的宏基因组学分析方法。a.在短reads测序平台上测序时，混合微生物群落的宏基因组鸟枪法测序reads会失去其基因组上下游信息,质粒也是同样情况。b.由于存在可引起DNA易位、重排和环化的重复序列和转座子等的存在，MGEs非常容易发生重组，由此导致的异质性使得宏基因组组装变得更复杂。c.转座子的移动性使宏基因组的组装更复杂。d.存在于多个基因组或相似区域的MGEs可能错误匹配来自微生物组内不同MGEs或基因组的测序reads。e.含有MGEs的contigs通常无法被分箱和/或只分到宿主基因组。而且，许多移动基因根本无法被注释到。
2.1 短reads比对水平转移基因可以通过将测序reads或组装的序列比对到参考基因组来进行检测。参考基因组覆盖范围内的大缺口或极端峰值可能反映了测序样本中存在HGT结构变异。同样，双端测序reads单独比对到不同的参考基因组或单端reads部分比对到不同的基因组也可能表明存在基因转移、基因获得（gain）或基因丢失（loss）的重组。MetaCHIP就是这样一种检测组装contig中开放阅读框（ORF）的最佳匹配同源基因的方法。发生转移的DNA的一个特点是组装序列的一部分跟其他基因组具有高同源性而跟两侧DNA的同源性较低。另一种方法是在参考基因组中寻找没有reads比对而其余位置覆盖度正常的区域。DGEFinder和DaisyGPS中整合的SRID正是利用这一原理，目前已在基因组和宏基因组数据中得到应用。MetaCHIP有助于在组装的序列中寻找转移DNA，而SRID更适用于分离的或参考基因组。但是由于这种方法是从密切相关的物种和单个基因组中收集reads，容易出现假阳性，因此这种结果的解释需要非常谨慎。 2.2 分箱法对宏基因组原始测序reads或组装的contigs进行分箱获得完整度更高的基因组的同时也可以获得更佳的MGEs组装，并且在一些研究案例中，还可以获得MGEs和细菌宿主的关系信息（图2e）。分箱方法需要用到k-mer或GC组成和/或k-mer或contigs的丰度等信息。然而，这种方法已被证明对与一个宿主（即宿主特异性噬菌体）有更紧密联系的MGEs是有用的。基于丰度分布对宏基因组组装的时间序列contigs进行涌现自组织映射聚类分析已用于在婴儿肠道中发现表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）特异的噬菌体和质粒。同样，潜在菌株分析，一种基于大量相关样本中单个reads的k-mer分布的分箱方法，也能够找到噬菌体及其宿主基因组。这些方法提供的MGEs信息并不完整，但同时也表明我们有机会进一步改进宏基因组组装技术和方法，帮助分析微生物群中快速进化的MGEs。 2.3 质粒或噬菌体直接测序噬菌体测序为了解微生物系统的生态学信息打开了大门，这些微生物系统似乎在改变群落结构方面起着关键作用，例如，噬菌体可能影响婴儿发育中的微生物群落形成，并且在炎症性肠病和营养不良等状况下会发生改变。不同的分析方法需要收集的噬菌体浓度可能差异很大，有时需要大量样本（例如，人体粪便的样本量要超过500 g），要根据实验方案具体问题具体分析。噬菌体基因组的异质性（DNA或RNA，单链或双链）也给分离工作带来了困难。除了从宏基因组数据中鉴定原噬菌体（prophage），还可以在忽略各自的宿主的情况下直接分离裂解噬菌体（lytic phages）并测序来检测它们的基因含量，常用的方法包括使用CsCl密度梯度离心分离噬菌体、正切流动过滤和聚乙二醇沉淀等。这些方法适用于体积较小的病毒或病毒样颗粒，而在废水或人类肠道中鉴定出的几种大体积病毒可能会被遗漏（例如，感染普氏沃菌属（
Prevotella
）的97 kb的crAssphage和540 kbmegaphage）。此外，这些方法容易丢失样本，因此建议使用染色、功能筛选或使用16S/18S rRNA引物检测是否存在基因组DNA污染。对从宿主分离出来的质粒进行测序可以揭示质粒相关转座元件的重组频率的差异，并已被用于鉴定牛瘤胃和污水处理厂污泥等各种环境中的功能差异。质粒可以用碱裂解法分离，效率可能因微生物组类型或之前提及的过滤方法而不同。通过使用质粒安全的核酸外切酶选择性消化线性DNA和多重置换扩增（利用Φ29聚合酶功能有效扩增质粒），可以在宏基因组DNA制备时富集质粒DNA。另一种称为“转座子辅助捕获”的质粒扩增方法是用携带抗生素抗性的转座子标记分离的质粒，然后在外源宿主（如大肠杆菌）中扩增，再利用抗生素选择并复原质粒。但是，要准确定量自然群落中质粒的丰度或拷贝数目依然难以实现。通过将病毒组测序与微生物组测序相结合，有时可以通过分析CRISPR序列来鉴定可能的宿主。作为细菌适应性免疫反应的一部分，有害的噬菌体或质粒感染时，细菌CRISPR-Cas系统通过将转移DNA的互补链整合到自身CRISPR序列，作为此次暴露的记忆保存下来，以抵御其再次感染。此方法已被用于分析宿主相关环境和海洋环境中的HGT。在某些情况下，这种方法可以分析单个CRISPR元件和它们的MGEs靶点的联系，并且如果能对contigs进行分类学注释的话，还可以分析其宿主细菌关联。 3 MGEs的额外基因组背景3.1 反向PCR整合MGEs的上下游序列在组装过程中发生丢失，特别是对一些特别混乱的MGEs而言。尽管reads的共线性可以用于确定MGEs紧挨的基因组上下游的信息，但是这种方法受到单个短reads比对质量的限制。相反，反向PCR是一种低通量、基因或MGEs特异的方法，可用于通过对感兴趣的基因或MGEs的附近区域进行测序来获取MGEs的上下游序列，也可能额外获得分类信息。反向PCR不是设计扩增内部DNA片段的引物，而是能够对两个引物外部的区域进行测序。简而言之，DNA消化成大的片段（几万bp甚至更长）再进行环化，然后利用朝外的引物对远端区域进行扩增。该方法已用于废水群落携带的可移动抗抗菌基因的分析。但它的效用取决于MGEs上下游序列的基因组多样性。例如，如果物种级别的标志物基因恰好位于MGEs附近区域时，使用反向PCR就可以确定其细菌宿主的种类。 3.2 长读长和合成长读长测序自然群落中的MGEs从1kb到1Mb不等。在肠道微生物组中，两个噬菌体家族，crAssphage和Lak megaphages（大于500kb），非常常见。Illumina鸟枪法测序产生最多600bp的双端reads，因此，长读长测序技术虽然错误率比较高，但是可以应用于MGEs和其他难以组装的基因区分析。较新的技术，如对一较大范围产生的DNA片段进行标签标记并使用
10X Genomic
s技术平台进行测序，已用于检测种间的差异，但这些方法现在还处于发展完善阶段。PacBio的SMRT技术和Oxford Nanopore测序技术等长读长测序技术通常对大于10万bp长度的序列测序良好，后者甚至可以较好地对100万bp地序列进行测序，这样的长度完成可以横跨一段复杂的转座子插入、一个前噬菌体序列、甚至一些全长的质粒。这种方法的错误率和测序成本都要高于Illumina等短读长测序平台，但这些指标也在快速改善中。最终选择哪种测序方法还是“鱼与熊掌兼得”，取决于你的研究目的是检测MGEs还是检测序列变异等。这些获得长段连续基因序列的方法在整合元件分析和组装发生重组的质粒时非常实用，但是，它们对于分析非整合质粒和宿主微生物的联系非常受限。 3.3 甲基化标志MGEs暴露于宿主甲基转移酶并获得与其宿主DNA匹配的甲基化模式，因此这些物种特异性甲基化特征可用于将MGEs与其宿主基因组结合。DNA甲基化可以通过亚硫酸氢盐测序，PacBio的SMRT技术或IonTorrent’s的long-read测序技术进行检测，因为DNA的化学修饰可以影响测序的动力学。已有研究利用这一特征分析MGEs和小鼠肠道宿主微生物组基因组和简单奶酪微生物组之间的关系。广泛利用这种方法的挑战之一是需要一个能够提供DNA序列甲基化状态的技术平台，要么是通过亚硫酸盐测序或SMRT测序，这些方法比短读长测序方法通量低又价格高。而且，这种方法也仅限于较长的MGEs，其中包含足够的独特或可识别的甲基化基序，以便能够确定宿主和MGEs的关系。除此之外，甲基化模式也可能受环境刺激而发生改变，这也就限制了这种方法在检查质粒-宿主关联随时间变化或比较不同宿主中存在的相同MGEs时的效用。 4 将MGEs与其宿主相关联4.1 比较基因组学全基因组序列的比较基因组学已经成为检测HGT的金标准，这种方法可以为联系整合MGEs和质粒与宿主提供高质量的数据。尽管基因组测序的通量很低，并且可能只包括了群落的一部分，但它仍然可以在各种环境中构建HGT网络，如肠道微生物群和奶酪微生物群等。培养组学的进步实现了在微生物组中获得远超以往的多样性数据，从而能够更全面地了解HGT网络。但是，分析过程中必须注意避免污染（可能错误地判断HGT）和在培养过程中引入人为影响，例如在培养过程中发生的接合以及质粒的获得和丢失。在亲缘关系近的菌株中，检测水平转移区域需要观察不同菌株之间的DNA片段，且这些菌株不是由基因丢失所产生。另一些研究则采用简单、保守的启发式方法来识别新近转移的DNA，他们通过检测近亲生物中几乎相同DNA的长度或通过检测测序基因组中的插入位点来识别远亲生物中几乎相同的DNA来识别远亲生物中几乎一模一样的DNA片段。依靠更精细的技术（例如，密码子使用的差异），在具有不远不近亲缘关系菌株中识别新近HGT的区域则可能更具挑战性。单细胞测序等新技术有望将可用基因组的数量增加几个数量级。借助细胞分选、微流控或水凝胶分离的单细胞测序具有一下几个吸引点：它不需要培养条件的先验知识；从分类学上它不存在偏倚；操作量更低；理论上通量高于需要克隆选择的基于培养的方法。单细胞测序并非没有需要注意的地方，这种方法因为组装通常是不完整的，比分离株测序更片段化化，也更容易受到污染。单细胞测序与宏基因组学相结合提供了在群落中识别移动基因的可能性，然后可以在大量样本中调查移动基因库，以及分析不同样本中MGEs结构的差异。 4.2 微生物群落中可移动报告结构传统的体外HGT研究方法是在质粒或噬菌体基因组中构建报告系统，通过荧光或抗生素选择进行检测，这些方法可以很好地检测自然群落和生物被膜中的接合作用（图3）。HGT的发生率可以从转接合子、转化子或转导子数量随时间的增加情况进行推断。这种方法只适用于那些可以被基因改造或易处理的MGEs，目前已经体内追踪微生物群落中的HGT得到应用并取得一定成果。在最近的一项研究中，一种经基因修饰的噬菌体SopEΦ被整合至两株可追踪的沙门氏菌血清型鼠伤寒亚种中。通过噬菌体携带的抗生素抗性特征的接合也鉴定出一种新形成的溶原性细菌，从而产生具有不同抗性谱的供体和受体细菌菌株。另外，通过对噬菌体病毒粒子的一部分进行条形码标记，研究者能够检查独立转移事件的发生率，并得出转移事件的频率必须很高的结论。 
图3. 用于检测水平基因转移受体和MGEs转移情况的报告系统。a.荧光报告系统是目前研究HGT的主要手段之一。b.基因组报告系统现在可被用于监测特定MGEs的转移情况。 将这个方法应用到多个MGEs或各种生物可能具有一定的困难。关于抗生素耐药性报告系统的使用，生物对抗生素的耐药性存在天生或后天的差异，这可能会模糊对新获得耐药性特征的物种的检测。另外，荧光素报告系统可用于筛选不同物种间的HGT事件，但不同物种间的表达可能不同。在一项实验中，从土壤群落中分离的质粒被改造成可以表达绿色荧光蛋白（GFP）并导入供体细胞，供体细胞携带红色荧光蛋白（RFP）和一个抑制GFP表达的启动子，因此GFP只能在接受质粒的细胞中表达。在这些细菌供体和土壤群落之间进行实验室接合实验，然后进行荧光激活细胞分选和16S测序，从而揭示能够获得质粒的转接合子亚群。这项研究的结果令人振奋，它表明在细菌中存在着广泛的基因转移事件。由于这种方法可能会因异质细菌亚群的分类而出现假阳性，因此必须进行基因确认。病毒标记在分析噬菌体-宿主相互作用上也很有效。分离的噬菌体用荧光标记并吸附到特定宿主的细胞膜上，然后进行批量测序或被重新引入微生物群落中，并通过荧光激活细胞分选对其进行分选。这种方法可以在不需要基因工程的条件下提供有关噬菌体-宿主相互作用的综合信息。像标记SopEΦ噬菌体这样的一些使用基因报告系统的方法，可以利用下一代测序提高分析的通量。Cas系统也可以用于感应记录HGT事件。Cas1和Cas2蛋白可以将移动DNA元件整合到间隔序列上。将Cas1和Cas2整合到大肠杆菌报告株，并将该报告株接种至微生物群落中，然后可以通过对CRISPR阵列进行测序来确定细胞暴露的情况。 4.3 邻位连接技术Hi-C是邻位连接技术的一种，这是一种在测序前产生由基因组内DNA相关蛋白介导的大范围DNA-DNA相互作用的方法，可用于分析移动基因及其宿主基因组的相互作用。Hi-C最初是用来测定真核生物的染色体结构的。简言之，当细胞完整时，细菌的DNA通过DNA结合蛋白之间的甲醛链交联，然后对细菌胞体进行消化，并用生物素标记并在稀释溶液中进行连接，以将DNA片段结合在同一交联复合物中。接下来，浓缩生物素化片段并测序以揭示存在于原来细菌中的DNA远端区域之间的相互作用。尽管Hi-C的主要用途是提高微生物组样本基因组组装的质量，但Hi-C测序也能够用于分析细菌染色体或其远端部分与其质粒或噬菌体的相互作用，甚至也能用于环境或人类微生物组中的相关分析。一项针对MGEs的研究利用Hi-C证明HGT导致MGE在个体肠道微生物群落中的广泛分布。这引发了特定MGEsHi-C分析方法的发展，该方法的计算流程专门用于分析MGEs与其宿主相互关系，并且该方法可用于分析已知的宿主-MGEs关系，证实了这种方法的可靠性。基于同样的前提，XRM–seq可用于分析rRNA与总mRNA的交联关系，包括正在转录的病毒mRNA。嵌合的reads同样可用于分析活跃的病毒基因组与其细菌宿主的关系。邻近连接技术有利于全面分析,可以在各种细胞中捕获质粒、前噬菌体和转座元件。由于Hi-Creads与具有少量碱基对（平均为read的一半）的contigs进行比对，因此Hi-Creads可能比对到多个位置。因此，数据的解释必须考虑到MGEs的冗余性。此外，大多数成对的reads在基因组内彼此接近，也就是说，他们不适用于分析MGEs与新插入基因组相关关系。另外，这种方法也不适用于相互作用少的情况。然而，值得注意的是，这种方法可以高通量、无偏倚地分析MGEs与其宿主基因组的相互作用。 
图4. 用Hi-C技术分析MGEs和宿主的相互关系。第一步：MGEs和染色体交联。第二步：限制性核酸内切酶消化。第三步：稀释连接。第四步：配对reads将MGEs和基因组相联系。 4.4 单细胞融合PCR融合PCR方法已被用于研究稀有基因与宿主的关系，而现在这种方法正慢慢地应用于可移动基因。例如，epicPCR已被用于检测具有高灵敏度的特定靶基因的细菌宿主。在PCR过程中，功能基因与来自同一细胞的系统发育标记融合（图5）。该方法已用于分析废水微生物群落中可移动抗生素抗性基因与宿主的关系，但其缺点之一是封装珠子的生物材料可使质粒等染色体外元件逃逸并污染相邻珠子，进而通过错误地将质粒和宿主联系而增加假阳性率。另一些类似的方法也正在开发当中，例如OLI-PCR，以实现对对可移动基因及其宿主进行灵活准确的捕获。 
图5. 用于分析MGEs和上下游序列的PCR方法。混合群落中的单细胞被水包油乳剂捕获，大部分泡泡是空的，其余都只含有一个细胞。一个标准的PCR以移动基因作为靶点，另一使用桥接引物的融合PCR可以将一个移动基因（橙色）的扩增子与一个分类标记物（蓝色）物理连接。因此，最终的扩增产物将只包含与标记基因的PCR融合，可以提供有关特定宿主或移动基因共存的信息。 5 深入了解群落中的HGT在上述技术的帮助下，我们对可移动基因的类型、它们的基因组及上下游有了更广泛的了解。由于这些技术能够研究是什么发生了转移、如何转移以及在谁之间转移，因此现在我们有必要在HGT和自然选择双重过程的背景下了解HGT在塑造微生物群落中的作用（图6）。 
图6. 理清HGT和自然选择的过程。a.在自然微生物群落中，能够观察到MGEs的水平基因转移和随后受到的自然选择压力的联合现象。b.可移动基因丰度的增加可能是由于少数宿主（左侧）的复制或基因在整个群落中（右侧）中的扩散所致。 5.1 广泛的微生物组内转移是可能的在对来自不同环境的数千个参考基因组进行分析后发现，除了遗传相关性之外，一些共同的生态学因素也控制着HGT过程。然而，同一环境中的生物体参与 HGT的程度尚不清楚。如前所述，多项研究揭示了通过使用荧光报告基因进行极其广泛原位转移的可能性，另一项研究通过供体大肠杆菌菌株将小鼠微生物组的GFP整合至能感染多种宿主的质粒，发现这种质粒能够在不同门物种之间进行传播。而且，与在体外将报告菌株引入同种微生物组样本相比，这种情况在小鼠肠道内更明显。体外土壤群落中的类似实验表明，三种不同细菌物种携带的三种不同质粒能够跨门转移到大量细菌中。这些实验强调了是自然选择而不是随机散布在影响移动基因库中发挥着作用。同样，一些正在进行的研究表明，移动基因在单个个体的肠道微生物群中广泛存在，证实了接触率和共同环境条件可能有利于HGT的发生和特定MGEs的选择。但是，我们还需要进一步研究共生生物和过渡生物间HGT的贡献，并更好地评估环境之间HGT发生率的差异。 5.2 HGT是间断性地爆发而不是逐渐发生几项体内实验结果表明，宿主相关微生物组中的基因转移发生率可能很高。而在小鼠鼠伤寒沙门氏菌感染实验中，噬菌体转导发生在急性炎症期间。通过管饲法整合携带GFP质粒的细菌可以在接种后的几天内转移到多个宿主。Cas1-Cas2报告实验结果显示，在将生物体引入肠道微生物组后数小时内，在接入几小时后间隔区的整合会出现一个初始爆发期。现在还无法确定控制基因转移速率的因素是否受接触、环境还是细胞压力信号所驱动，但这些实验表明基因转移可能同时发生在许多生物体中，而不是以一定的规律定期发生。 5.3 MGEs受到复杂的选择压力目前非常令人担忧的是在MGEs上常见抗生素抗性基因的传播。有研究表明旅行者在旅行后会积累更多的抗生素抗性基因，这表明个体的移动基因库是灵活的，并受到选择压力的影响；然而，此过程的发生规模和时间范围尚无法清楚。尽管在某些情况下有相同的烹饪习惯，但有研究证明可移动碳水化合物降解基因在全球人群的肠道微生物群之间存在着差异。生物和MGEs通过污水处理厂的输送过程中，微抗生素抗性基因也没有得到保留。因此，我们需要了解自然选择对不同基因组中可移动基因的作用。通常，可移动基因，包括提供辅助功能的基因和与携带外源DNA相关的基因，可能是有害的，并且在保留MGEs的基因组中经常发现补偿性突变。一项描述性研究结果显示，各种生物肠道中抗菌肽抗性基因和抗生素抗性基因的活动性和功能均存在差异，这项工作揭示了抗菌肽抗性基因与其宿主基因组需要更高要求的功能相容性。总的来说，显著影响可移动基因库的选择压力的研究之旅我们才刚刚起步。 5.4 MGEs与其细菌宿主基因组之间的相互作用越来越多的证据表明移动元件与其细菌宿主基因组之间存在相互作用，包括与宿主物种功能相关的特定相互作用，如质粒相关基因调节鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii基因表达模式以促进尿路定植。单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes中的一种噬菌体在吞噬作用过程中可以被转导并促进吞噬体内的细菌存活。值得注意的是，这还包括由噬菌体编码的抗CRISPR系统。这些细菌宿主相关性状在MGEs上携带的普遍程度尚未以高通量方式进行评估，但它们表明MGEs与其宿主基因组之间存在共同进化的现象。 6 展望尽管用于HGT的分析工具越来越多，但仍有许多问题可以应用其中的一些工具。HGT的潜在动力学尚不清楚。在炎症小鼠模型中使用噬菌体表明，单个微生物群落内的HGT非常快速，然而，尽管我们观察到广泛的可移动基因的快速传播，但我们不知道控制成功或持续产生基因转移的生态基础以及这种情况在自然环境中发生的频率。上述技术都无法提供自然群落中HGT事件的全貌，而且这些技术的全面性、灵敏度、MGEs长度、总通量以及广度和准确性等指标有所不同。对于群落中的HGT事件，这些技术中只有少数可以用于分析MGEs与其细菌宿主的相互作用，目前没有人阐明基因流动的方向，甚至转移的机制—转导、转化、结合——也尚未阐释清楚。此外，还有其他可能的HGT机制，例如通过外膜囊泡，我们也对此知之甚少。为了回答这些HGT的系统级问题，我们需要更加稳健、更高通量和更低成本的方法，这样才能应用于大型比较病例对照研究或时间序列研究。这些技术有望回答HGT在微生物群落中起到的作用的生态学问题。HGT何时会导致可能影响微生物生态系统或宿主变化的持续基因组整合？抗生素在选择和促进HGT中发挥了怎样的作用？哪些MGEs处于正向选择之下，个体基因又做出了什么贡献？哪种HGT模式占主导地位，这在不同微生物组之间又有何不同？因此，我们需要可以测量MGEs在新插入基因区域的效用的方法来检测保留或丢失可移动基因的选择压力，因为获得MGEs最初可能是有害的。判断新近获得的MGEs是否在群落中表达的一种方法是分析基因组数据和蛋白质组数据。即使本文描述的最稳健的方法也无法全面捕获微生物群落中的所有HGT。本综述中概述的方法都面临着提高信噪比和灵敏度的挑战。然而，除了检测问题之外，基因转移现象存在着大量障碍也是导致在群落中未观察到HGT的原因之一。其中一些是目前已知的：例如，限制性核酸内切酶的活性、不相容的HGT机制、噬菌体吸附特异性和适应性CRISPR介导的免疫等。但是，也有一些颠覆我们假设的复杂情况会出现，例如，可以绕过宿主修饰或CRISPR机制的噬菌体。这些障碍对自然群落中HGT的贡献可能需要这里讨论到的方法以外的方法。随着微生物组研究更好地在物种水平上了解群落组装，我们需要将更多的注意力集中在基因转移过程中仍然难以解释的方面。今后，科学家们将越来越多地关注HGT作为抗生素耐药性传播的驱动因素，以及分析具有重要生态作用的细菌群落如何适应不断变化的环境条件。微文推荐阅读 微生态最值得看的38篇农林牧渔微生物文章解读盘点（免费赠送文献包） 微生态最值得看的12篇口腔微生物文章解读盘点（免费赠送文献包） 微生态最值得看的46篇土壤微生物研究文章解读盘点（免费赠送文献包） 2020年度回顾 | 微生态人体微生物类微文大合辑 2020年微生态最值得看的环境类微文回顾
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