构建打耙载体首先要获得用于同源重组的同源臂序列。同源臂序列可以通过筛选小鼠基因组文库来获得，目前小鼠基因组测序已基本完成，因此可以通过更简单有效的聚合酶链反应 (polymerase chain reaction， PCR) 方法来获得。为了提高同源重组效率，同源臂 序 列 最 好 来 自 于 要 操 作 的 E S 细 胞 品 系 (Rigle et al. 1992)，序 列 长 度 一 般 要 求4——10kb(Deng et al. 1992)，因此采用能扩增较长片段的高保真 D N A 聚合酶进行 PCR 扩增。要考虑的影响 PCR 成功的主要因素有：

(I)D N A 模板。 D N A 模板的完整性和纯度至关重要，其平均长度至少应该是预期的P C R 扩增产物长度的 3 倍以上， OD2602/OD280比值 应 在 1.8 左右，以 使 P C R 抑制剂的含 量降至最低。

(2) D N A 聚合酶。现已有多家公司开发了适于扩增较长片段的高保真 D N A 聚合酶。笔者曾以 8.2.5 的方法提取的 E S 细胞基因组为模板，用 Stratagene 公 司 的 PfuUltm 聚合酶 ，用 Touchdown P C R 方法成功扩增了 4.2k b 的片段，测序后发现无一突变。用 TaKaRa公司 的 Pyrobest D N A 聚合酶进行巢式 P C R ，成功扩增了 2.6k b 的片段，测序后也发现无一突变。

(3) 引物。引物设计的一般原则必须遵守。用于较长距离 P C R 的引物一般较标准 P C R的引物稍长些 (25——30bp)。两条引物的退火温度要大致相等。引 物 5’端可引入合适的限制性内切核酸酶位点以便后续 D N A 操作。具体方法请按常规分子克隆方法进行。以下是笔者获取同源臂序列时使用的方法，仅供参考。

8.1.1.1 T o u c h d o w n P C R

8.1.1.2 P C R 产 物 的 纯 化

的液体，将柱子重新置于收集管上。 (7) 加入 500ul 洗膜液， 16000g 离心 5min，将柱子置于新的1.5ml 离心管上。

(8) 加 入 50ul 无菌水，室温孵育 Imin, 16 OOOg 离 心 lmin，将洗脱液储存于-2℃备用。

P C R 产 物 加 尾 取 l——7ul 纯 化 的 P C R 产 物 ，加 人 1ul IOxTaq D N A 聚合酶反应缓冲液 (含 MgCl2)、lul2 mmol/L d A T P 、 lul T a q D N A 聚合酶，加水补足 10ul， 70℃，孵 育 15——30 min。

P C R 产 物 与 p G E M -T e a s y 载 体 的 连 接

pGEM -T Easy 载体为 Prom ega 公司产品 (Cat.# A 1360)。

(1) 使 用 前 振 悬 2x 快 速 连 接 buffer。

连 接 产 物 的 转 化 (1) 用常规氯化钙法制备感受态细胞。如达不到要求，可用清华天为时代公司的感受态细胞。

(2) 取 5ul 连 接产物与 I O O P 感受态细胞冰上混合，冰 浴 30 min。

(3) 42℃热 激 90s，再置冰上 2——3 min。

⑷ 加 入 800ul L B 培养基， 37℃ 、 150r/m i n 振荡培养 45 min。

(5) 7000r/m i n 离 心 2 min，扔 弃 800ul 上 清 ，将 余 下 IOOul 与沉淀混匀，均匀涂布于含有合适抗性的 L B 平板上。

(6) 37℃ 培 养 16〜 18 h ，挑选转化子进行酶切和测序鉴定。

较 长 D N A 片段之间的连接有时会成为体夕卜 D N A 操作的障碍。以笔者的经验，采用Promega 或 Qiagen 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 D N A 片段，采 用 TaKaRa 公司的D N A 连接试剂盒 (DNA Ligation Kit Ver.2,1; Catalog No. D6022) 进行连接，问题往往迎刃而解。

酶 切 与 回 收

用合适的限制性内切核酸酶酶切 2ug 含插人片段的 p G E M ®-TEasy 质粒和打靶质粒。按上述方法从琼脂糖凝胶中回收插入片段和打靶质粒

目 的 片 段 与 打 把 载 体 连 接

用 T a K a R a 公 司 的 D N A 连接试剂盒。

⑴ 按 摩 尔 比 3 : 1 混合目的片段与打靶载体，总体积为 5〜 10ul，加入等体积的溶液 L混合均匀。

(2) 1 6 ℃ 反 应 30 min 后转化。加 入 1/10体积的溶液Ⅲ，可增强转化效率 2-5 倍 。

(3) 37℃培 养 16〜 l8 h ，挑选转化子进行酶切和测序鉴定。

质 粒 提 取 制备电穿孔转染用质粒，最 好 用 Qiagen PlasmId Midi Kit(Cat. N o .12143)。由于插入了长同源臂序列，打靶载体的拷贝数有时会显著降低，此时应增大培养体积。

8 . 1 . 2 . 4 打 靶 载 体 线 性 化

采用线性化 D N A 能获得较高的同源重组效率 (Hasty et al.1992)。打靶载体在电穿孔转 染 E S 细胞前要线性化，因此在设计打靶载体时，其中一个同源臂的末端应该有单一酶切位点。载体中通常选择凡 HSV-TK 基因作为负选择基因，如 果 TK 基因在打靶载体的末 端 ，常常会在转染过程中被破坏。因此最好在远离汉基因的一个同源臂能有单一酶切位点，这样，载体线性化后汉基因不会在末端。

酶切及乙醇沉淀方法请按常规分子克隆方法操作，以下流程供参考。

(6) 12 000r/m i n 室温离心 5 min，在无菌超净台中小心弃上清，干燥沉淀。

(7) 加 人 约 5 0 0 无菌水重悬 D N A ， -20°C 保存备用。

中 靶 E S 细胞筛选和鉴定的方法已经很成熟。以下是军事医学科学院生物工程研究所发育与疾病遗传学研究室已成功使用的方法。

制 备 原 代 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 滋 养 层

S T O 细 胞 株 和 原 代 小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 都 可 用 于 支 持 全 能 胚 胎 瘤 (embryonalcarcinoma， E C ) 细胞系和 E S 细胞系的生长。 Suemori 和 Nakatsuji(1987) 比较了 S T O 和原 代小鼠胚胎成纤维细胞对小鼠 E S 细胞的影响，发现原代小鼠胚胎成纤维细胞更适合于小 鼠 E S 细胞的培养。从各种小鼠品系中分离的胚胎成纤维细胞在支持 E S 细胞生长的功能方面没有显著性差异。用于打靶实验的胚胎成纤维细胞必须具有筛选抗性，通常可从携带抗性基因的转基因小鼠或基因敲除小鼠中分离。

⑴ 将 怀 孕 13.5〜 14.5 天的母鼠处死，打开腹腔，取出胚胎，放入无菌的直径为 90m m的培养皿中。

⑵ 去 除 卵 黄 囊 、羊膜和胎盘，将胚胎在新鲜的 P B S 中 洗 2 次 。

(3) 用一对镊子将胚胎的头及内脏去除，用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片 (约 1m m 3)，加 入 P B S 洗至液体基本无色。

⑷ 将 胎 鼠 碎 片 转 移 至 含 P B S 的 15m l 离心管， lOOOr/m i n 离 心 5 min。

(5)弃 上 清 ，加 入 5 ml 0.25% 胰蛋白酶， 37°C 放 置 30 min，加 入 含 10% 胎牛血清的D M E M 培养基，用吸管反复吹打。

(6) 为去除大的细胞团块，将细胞悬液流过 2 0 0 目筛网，然 后 lOOOr/m i n 离 心 5 min。

(7) 弃上清，加入饲养层细胞培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到 150m m 培养皿中，置 于 含 5%C0 2 的细胞培养箱中 3 7 ℃培 养 2——3 天 ，通 常 第 3 天胚胎成纤维细胞已长满培养皿。此时记作第 O 代 (P0)。可将细胞用冻存培养基 (15% F C S ，10% D M S O ,75% D M E M ) 按 2xl06 个/m l 的密度冻存，待需要时再复苏，按 1 : 3 传代培养。

(8) 当 第 4 代细胞长满时，更换新鲜的饲养层细胞培养基，加 入 终 浓 度 为 1 〇 ug/ml的丝裂霉素 C(mit 〇 m y d n C ) ， 3 7 ℃继续培养 2 —— 3 h 后使其停止生长。

(9) P B S 洗 5 次 ， 0.25% 胰蛋白酶消化，计数。

(10) lOOOr/m i n 离 心 5 min，加人合适体积的冻存培养基，使细胞密度为 2xl 〇 6 个/ml，用吸管吹打混勻后冻存备用。通常直径为 I O c m 的培养皿需铺 IxlO6个细胞建立伺养层。

制 备 600m l 饲养层细胞培养基可参考以下配方：

D M E M 500 ml

谷氨酰胺 6 ml

非必需氨基酸溶液 (10mol/L， IOOx) 6 ml

青链霉素溶液 (5000U 青霉素， 5m g 链霉素/100 ml) 6 ml

巯基乙醇 4 ul

胎牛血清 90 ml

用一次性过滤瓶过滤，置 于 4 ℃冰箱中备用。在此培养基中添加 1000U /m l 白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 即可用于 E S 细胞的培养。

培 养 E S 细 胞 所 需 的 试 剂

(1) 水 ：水的质量至关重要，推荐使用经 Millipore-Q 纯水系统过滤过的蒸馏水或购买的超纯水。

(2) D M E M : 培 养 E S 细胞的基本培养基主要采用高糖 (4.5 g/L )，含 L -谷氨酰胺(4.0 mmol/L ) 的 D M E M 干粉培养基。培养基干粉溶于超纯水中，用 H C l 调 p H 至 7.2, 然后 用 0.22um 的微孔滤膜过滤至无菌容器中。 D M E M 也可使用购买的液体培养基，并能在 4°C 保 存 2——4 个 月 。由于 D M E M 中的谷氨酰胺不稳定，容易降解，因此，在 D M E M储 存 1 4 天后，必 须在 D M E M 中加入 2 mmol/L 的谷氨酰胺。

(3) O.lmmol/L 非必需氨基酸 (lOOxstock)。

(4) lOOug/ml 青-链霉素。

(5) 200 mmol/L L -谷氨酰胺 (lOOxstock)。

(6) 15% 特级胎牛血清：胎牛血清是影响 E S 细胞生长状况的重要因素。过高浓度的 胎牛血清并不利于 E S 细胞的生长，不同批号的胎牛血清也具有不同的效果。因此，为了避免批次间差异，常选定一批适用的胎牛血清大量冻存于-20°C 以备用。可从血清供应商购买胚胎干细胞级胎牛血清，这些血清已经过筛选，对 其 维 持 E S 细胞增殖而不分化的能力作了鉴定。

(7) 10-4mol/L β-巯基乙醇 (IOOxstock): E S 细胞培养基中加入β-巯基乙醇，对胚胎细胞的分裂增殖有促进作用。某 些 E S 细胞系，如 T C -I E S 细胞，对 A 巯基乙醇具有依赖性，不加β-巯基乙醇， E S 细胞不能存活。

(8) lOOOU/m l 白血病抑制因子 (LIF)。

(9) 不 含 Ca2+和 M g 2+的 P B S 缓冲液： IL P B S 的配制包括如下试剂， IOg NaCl，0.25 gK C 1， 1.44 g Na2 H P O 4, 0.25 g K H 2P O 4, p H 调至 7.2, 高压灭菌。也可使用购买的 PH 7.2的 P B S 缓冲液。

(10) 胰蛋白酶： 0.25% 胰蛋白酶， 0.02% E D T A 。

(11) 0.1% 明胶。

E S 细 胞 的 常 规 培 养

(1) 用 0.1% 明胶处理培养皿，按上述方法制备饲养层。

(2) 弃去原培养基，加 入 P B S 洗 1 次。

(3) 加 入 0.25% 胰蛋白酶-E D T A 溶 液 ，消 化 3——5m i n后 ，加 入 含 15% 胎牛血清的D M E M 高糖培养基中和胰蛋白酶。

(4) 用吸管轻轻吹打，直至成为单细胞悬液。

(5) 将细胞悬液按 1 : 3 的比例转移到新的含有饲养层的细胞培养皿，混勻后，置入5 % C 0 2、 3 7 ℃培养箱中培养。

(6) 每曰换液一次，一 般 3 天后可传代。换液前，需将培养基或所需溶液预热到 37°C或室温。传代应在 E S 克隆外周出现分化的内胚层细胞之前进行。

目前最常用的而且成功的方法是通过电穿孔技术转染 E S 细胞。采用电穿孔法转染E S 细胞，在获得理想转染效率的条件下，将 导 致 50% 的 E S 细胞死亡。影响转染效率和细胞存活力的因素包括电压、离子浓度、 D N A 浓度及细胞密度。对不同的 E S 细胞系而言 ，获得理想的转染效率和细胞存活力必须综合考虑以上各种因素并进行预实验。以下是基于在原代胚胎成纤维细胞上培养的 TCl E S 细胞的电穿孔方法：

⑴ 复 苏 的 E S 细胞传代后的第 2 天 (36 h) 进行转染实验。

(2) 转 染 2 h 前 ，换新鲜的培养基。

(3) 吸弃培养基，用 P B S 漂洗培养皿 2 次。

⑷ 每 直 径 90m m 培 养 皿 加 1.5 ml 。 25% 胰 蛋 白 酶 -E D T A 溶 液 ，37°C 、放 置 3〜 5 min。

(5) 加 3.5 ml E S 细胞培养基，用吸管反复抽吸， 2 0 次 。用血细胞计数板测定细胞总数 ，通常每个打耙载体每次转染约需 2xl0 7 个细胞。

(6) 1000r/m i n 离 心 E S 细胞悬液 5 min。吸弃上清，将细胞重悬于 10m l P B S 中。

(7) 重 新 1000r/m i n 离 心 5 min。将细胞重悬于 P B S 中，使细胞密度达到 2xl07 个/ml。

(8) 将 30——50ug 线性化的打靶载体 D N A 与 I m l 细胞混匀，装入电穿孔槽中，室温放置 5m in

(9 ) 在基因脉冲仪中电击 (600V ， 25uF)， 室 温 放 置 Imin。

(10) 将电穿孔槽中的细胞与 7m l 新 鲜 的 E S 细胞培养基混勻，分 入 4 个已长满滋养层细胞的直径 90m m 培养皿中。

(11) 将 4 0 ul未转染的细胞铺于一个直径 90m m 培养皿中作为对照。

(12) 24 h 后 ，换成含 G 418(280ug/m l) 和 gancyclovir(2umol/L) 的 ES 细胞筛选培养基，此后每天更换新鲜的筛选培养基。通常转染 7 天后可以开始挑取克隆。

(1) 转染后的 E S 细胞在药物筛选培养基中培养 7——8 天后，弃培养基， P B S 洗一次，再 换上 IOmI P B S。

(2) 将 2 0 0 0 自动移液器调整至 2 0ul，用枪头在显微镜下挑选抗性 E S 克隆。

(3) 转移每一个克隆到一个空的 9 6 孔培养板中。

⑷ 每 个 9 6 孔培养板的孔中加 50ul 0.25% 胰蛋白酶-E D T A 溶 液 ，37°C 作 用 3〜 5 min。

(5) 每 孔 加 人 100ul E S 细胞培养基。将 1 0 0 ul 八通道自动移液器调整至 80ul 此 用 枪头反复吹吸，使 E S 克隆变成单细胞悬液。将 每 个 E S 克隆的单细胞悬液等分至两个预先接种好滋养层细胞的 9 6 孔培养板中。两个培养板中克隆的位置和次序完全相同。

(6) 每天换新鲜的 E S 细胞培养液，培 养 2——3 天 后 ，将其中一块 9 6 孔培养板冻存。

(7) 将剩余一块 9 6 孔培养板中的 E S 克隆经胰蛋白酶消化后转移至预先接种好滋养层细胞 2 4 孔培养板中培养，长满后提取基因组 D N A 用于鉴定。

母次打祀头验通常要筛选 100——1000 个 E S 克隆。在 96 孔培养板中直接冻存 E S细胞可以大大减少工作强度和实验费用。

⑴ 吸 弃 培 养 基 ，加 人 1 〇〇ulPBS。

(2) 吸 弃 P B S ，加 人 50ul 用 P B S 稀释的 0.125% 胰蛋白酶-E D T A 溶液， 37°C 作用3——5 min

(3) 加人 1 〇〇ul 冻存培养基 (15% DMSO,2 〇% 胎牛血清， 6 5 % DMEM。

(4) 用八通道自动移液器分散并混匀细胞。用封口膜封好 96 孔培养板，并将其封人塑料袋中，培养皿表面和塑料袋表面均做好标记。

(5) 为了减慢冷冻速度，将培养皿放入泡沫盒中，再置于-80° C 冰箱中冻存。

如果确定要用 PCR 方法筛选，设计打耙载体时一侧同源臂长度通常应小于 3kb。 采用 0.6〜 1.2kb 长度的短臂最容易用 PCR 方法检测。如果同源臂序列过长，可尝试使用长距 离 PCR(long-distancePCR)。 要检测正确同源重组事件的发生， PCR 反应的引物，一条必 须 设 计 在 基 因 上 ，另一条引物则应设计在跨过打靶载体短臂，即打靶载体外侧的内源基因片段上。

(18) 将滤膜置于两张滤纸中稍事干燥，用保鲜膜包好滤膜，于暗室将滤膜置于 X 射线胶片夹中于—7 〇°C 加增感屏曝光 12——48 h 后显影。

(1) 取出冻存的 9 6 孔板，在 37T 孵箱中使细胞悬液尽快融化。

(2) 将细胞悬液移入接种有饲养层的 2 4 孔板中，放 入 5 % C0 2、 37℃培养箱中培养，次曰换液。

(3) 待 E S 细胞长到合适密度后 (通常 3 天)，消化细胞制成细胞悬液转移至 6 孔板中继续培养。

(4) 待 E S 细胞长到合适密度后 (通常 3 天)，消化细胞制成细胞悬液转移至 3 个 6 孔板中继续培养。

(5) 待 E S 细胞长到合适密度后 (通常 3 天)，冻 存 2 孔细胞，余下一孔或者用于囊胚注射制备嵌合体小鼠，从整体水平研究靶基因的功能，或者扩大培养后进行新一轮打靶实验，以获得携带两条突变染色体的 E S 细胞，从细胞水平研究靶基因的功能。至于囊胚显微注射以及胚胎移植的具体操作，请读者参照本书相关章节或相关文献，这里不再赘述。