实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的 基因过表达、 RNA 干扰、 microRNA 研究以及 活体动物实验中。在整合宿主基因组过程中，逆转录病毒（比如 MLV）通常大约 20% 的感染事件发生在转录单位的 5' 端，对 CpG 岛和 DNase I 超敏感位点附近有一定的倾向性。而慢病毒载体多整合到远离转录起始点的位点。因此，与逆转录病毒载体相比， 慢病毒载体似乎致癌可能性较低，临床应用可能更安全。重组腺病毒（Adenovirus，Ad）载体系统是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著的优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达 100%，全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是最具有潜力的一种基因递送工具。目前常用的腺病毒载体是基于人腺病毒 5 型（Ad5）的，其基因组是 36Kb 长的线性双链 DNA。腺病毒是通过自身的纤维（Fiber）和细胞表面的受体（如 CAR）结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装 (图 2)。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。

图 2. 腺病毒的基结构与感染过程

目前最常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因（GOI）首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均是腺病毒早期 转录复制基因 E1 和 E3 缺陷的 (DE1, DE3)，其中 E3 基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达 E1 的细胞系，比如 HEK-293，HEK-293A 等。腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）属微小病毒科 (parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的 AAV，所以 AAV 被称作腺相关病毒。典型的 AAV2 基因组约 4800bp 的单链 DNA- 被二十面体的外壳 -Capsid 包裹。AAV 的基因组包括 2 个反向末端重复序列 (ITR，145 bp) 和两个读码框 (ORF)-Rep 和 Cap（图 1）。ITR 对合成互补 DNA 链是必需的；Rep 和 Cap 可以翻译成多种不同蛋白，如 AAV 生活周期必需的 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40 以及包膜蛋白 VP1、VP2 及 VP3 等。

图 3. AAV 基因组结构与 Capsid（Cap）高频突变位点示意图。A. Capsid 晶体结构示意图。其中蛋白 VP1 表面不同颜色的氨基酸基团代表 Cap 高频突变位点。B. Cap 基因结构。其中 Cap ORF 编码 3 个蛋白 -VP1、VP2 和 VP3。高频突变区域用不同颜色的箭头表示，并对应到图 A 中 Cap 表面不同颜色的氨基酸基团。C. AAV 基因组结构。

需要着重提及的是，Capsid 表面一些关键的氨基酸残基（图 1A 中不同颜色的氨基酸）会与细胞表面的受体相互作用，介导 AAV 病毒的特异性感染到目的组织或脏器。目前 AAV 有 12 种血清型、100 多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性（图 4）。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV 被称为目前最适合在体研究（in vivo）基因功能的利器。

图 4. 不同的 AAV 血清型对组织或脏器的偏爱性。

我们综合比较下四种病毒载体系统的特点（表 1）：四种主流病毒载体系统的特点比较。

腺病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：

a. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统：腺病毒感染细胞后，1-2 天即可表达，是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统;

b. 滴度高：腺病毒系统在转有 E1 基因的 HEK293 细胞中可进行自我复制，可产生滴度为1010 到1011 PFU/mL 的病毒;

c. 载体容量大：可容纳不超过5kb 的片段;

d. 不整合到染色体中，无插入致突变性：腺病毒除卵细胞以外，几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应 。

AAV在基因传递和表达的优势

1.宿主范围广：随时可转染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂细胞；

2.多种血清型 ： AAV1,AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等；

3.安全性高：ITR 序列和rep/cap 基因分别由独立的质粒表达；未发现AAV 对人体致 病，rAAV 去除了wtAAV 基因组的96%，进一步保证了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因组仅4681 个核苷酸，便于用常规的重组DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；

5.扩散性强：AAV可以穿透血脑屏障，是最理想的神经元和胶质神经下感染工具。

腺相关病毒的局限性有哪些？

1. 体外实验表达水平较低：

主要是因为 rAAV 病毒的基因组是单链 DNA，在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。可以在体外水平感染 rAAV 病毒的同时感染辅助病毒比如 Ad5 型腺病毒或者终浓度 10~50 mM 的丁酸钠等方法提高细胞实验的 rAAV 表达量。

2. 需较长时间开始表达：

同样是需要从单链 DNA 变成双链 DNA，rAAV 在感染后需要较长的时间来表达外源基因，所以 rAAV 感染后建议至少 1 周后做切片观察。

3. 载体容量较小：

腺相关病毒载体作为基因治疗的载体，目前最多只能容纳4.7Kb外源DNA片段

慢病毒的优势：

1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；

2.可感染分裂和非分裂细胞；

3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；

4.可以更换特异性启动子；

5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

参考：

https://www.genechem.com.cn/index/products/product.html?cid=70

汉恒生物

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