三、慢病毒包装应用

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1病毒为基础发展起来的基因研究载体，与传统的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体具有在分裂和非分裂细胞中感染的能力。

实验平台的慢病毒系统属于第三代慢病毒系统，具有高生物安全性，采用VSVG包膜，宿主范围广泛，病毒滴度高，达到10^9TU/mL。

目前的慢病毒载体提供多种启动子选项，如CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等；同时，也提供多种荧光标记蛋白选择，如EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等；抗生素筛选基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供选择。

在细胞实验中，慢病毒包装可显著提高难转染细胞（如原代细胞、干细胞、不分化细胞等）的基因转导效率，并增加目的基因整合到宿主细胞基因组中的概率，极大便利了RNAi、cDNA克隆和报告基因的研究。

具体而言，慢病毒包装主要应用于以下几个方面：

对于难转染的细胞，可提高基因转导效率，并增加目的基因整合到宿主细胞基因组中的概率，有利于RNAi、cDNA克隆和报告基因的研究。

用于稳转细胞株的筛选。

为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液。

四、实验方法

五、案例展示

六、常见问题

慢病毒包装过程中常见的问题包括：

1.片段大小控制： 理论上，慢病毒可以包装5～7Kbp的片段，但过大的片段会降低病毒的出毒效率，导致病毒滴度较低，影响感染效果。建议将片段控制在1.5Kbp以内。

2.质粒突变和丢失： 病毒载体易发生突变和丢失，导致包装信号突变或片段丢失，阻碍病毒包装。建议在构建含目的基因的载体后进行测序，确保关键序列正确。

3.选择包装细胞： 建议选择生长旺盛、状态良好的293T或293FT细胞，避免过密生长和过多的体外传代。

4.转染条件优化： 对质粒纯度要求高，最好使用去除内毒素的超螺旋质粒，采用磷酸钙转染方法可以提高转染效率。

5.质粒比例调整： 转染时各质粒的比例对出毒效率影响显著，需要根据质粒比例进行调整和优化。

转染操作细节：转染前细胞密度控制在50％～60％，转染后不换液，但可以在第2天添加丁酸钠(TPA)提高出毒率。

6.病毒收获条件： 一般情况下，转染48h后收获得到的病毒颗粒最多，但细胞状态、生长速度和培养基pH值也会影响病毒收获。

7.血清筛选： 不同厂家和批次的血清对病毒产量影响很大，需要进行筛选。

8.病毒液保存： 避免病毒液反复冻融，以维持效率。

9.保存和检测： 病毒液可保存于-80℃中一年，但建议半年后重新检测病毒滴度。

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