翻译：骈亚亚1 刘一锋2 赵惠3    

主审：汤一苇 4  胡继红 1

1 北京医院 国家卫生健康委临床检验中心  2 首都医科大学附属北京友谊医院

3  广东省人民医院  4 丹纳赫中国诊断平台/赛沛

摘要：自2019年冠状病毒病（新型冠状病毒肺炎）爆发后的两年多时间里，感染性疾病分子诊断发挥了比以往任何时候都更大的全球化作用。鉴于此，作者广泛回顾了分子技术在临床微生物学中的进展，并指出其在当前的重要性。同时分析它们如何在技术创新、病理生理学知识、临床/实验室管理、甚至金融/监管因素的交叉点上形成医疗保健。   

微生物和DNA的诊断能力

细菌学理论作为现代医学的基本准则，其在临床微生物实验室的重要作用仍未改变：对引起疾病的细菌、真菌、病毒和寄生虫进行鉴定。

100多年来，显微镜观察、微生物培养和免疫学诊断一直是鉴定病原菌感染的主要方法。这些技术到现在仍不过时，依旧是鉴定许多病原菌的金标准。在过去的40年间，随着超敏感技术的发展，DNA/RNA作为诊断工具已经发生了翻天覆地的变化，分子诊断技术已经从单纯的概念演变为临床微生物学实践中不可或缺的工具。  

早期非扩增探针技术

在临床微生物实验室中，非扩增探针方法被用来替代传统的微生物分离培养或生化鉴定。它们可以在微生物培养后第一时间进行快速鉴定。用于检测阳性血培养瓶的荧光原位杂交（FISH）技术在21世纪初已开始普及，即利用单个探针直接检测引起菌血症的常见病原菌。最近，用于血培养的非扩增探针技术已经发展为可同时识别多个靶点的多重芯片技术。分子探针并不仅限于分类鉴定，也用于抗生素耐药检测。这些多重探针技术通常会利用其他表面和悬浮阵列及显式核酸扩增方法，因此处于不断发展中。

历史上，核酸探针也促进了信号放大技术的发展，包括杂交捕获和支链DNA技术。探针和目标序列的识别通过连续几轮核酸和/或抗体杂交得以增强，可最大限度提高检测值。目前，信号放大技术在很大程度上已经让位于核酸靶向放大技术。  

核酸扩增技术的出现

20世纪80年代初Mullis在Cetus公司开发了PCR技术，分子诊断学也随之诞生。PCR实验室设备的发展尤其是热循环仪的研发对PCR的发展至关重要。总的来说，诊断PCR可归纳为三个步骤：（1）样本处理和核酸提取；（2）目标扩增；（3）扩增产物检测或鉴定（图1）。  

“可视化”和定量扩增产物

虽然PCR可以指数扩增低丰度的DNA/RNA，但它的诊断效用却依赖于成对方法来检测最终产物。扩增产物检测必须简单、直接、可重复，以便临床实验室能有效使用。

在临床微生物学中最常用的PCR检测方法或许是荧光探针法。PCR早期里程碑就是通过荧光来主动监测扩增产物。荧光基团偶联的寡核苷酸可以提供更高的检测特异性。这些技术通常会用到荧光共振能量转移（FRET）原理。对于PCR检测来说，这些现象是通过将这些片段结合到单个探针的不同区域或多个针对相邻扩增子区域的探针来实现的。杂交修饰了部分的空间关系，使得发射仅在靶扩增时发生。杂交改变了分子的空间关系，使得只有在靶基因发生扩增的时候才会发射荧光。

图1 临床微生物学核酸扩增三步基本操作

图1 临床微生物学中核酸扩增分析的三步基本操作，包括样本提取、RNA/DNA扩增产物及检测/鉴定。对于每个步骤，图中总结了在临床环境中使用的不同技术/程序选择，其中诊断技术的重要类别还将（从概念上或仪器方面）归纳在一起进行总结，比如用于核酸扩增和检测的qPCR/qRT-PCR，以及各种高通量自动化和即时检测平台，通过工程学特性从一步到另一步连续切换。

虽然这一理论有许多变化，但水解法(或“TaqMan”)是最广泛使用的，不同荧光的独特发射光谱（跨越可见光光谱）使得多重检测成为现实。不同产物的扩增过程，可以通过它们各自荧光基团的发出颜色来区分，以此实现实验过程的实时追踪。

重要的是，像TaqMan这样的探针技术在概念上是简单的：每个靶基因对应一对引物和一个探针，这种方法可以合理地适用于不同的和/或新的微生物靶标。

除了这些优点之外，荧光PCR检测的一个关键优势是它能够实现定量检测。对于许多感染来说，医疗决策不仅基于病原体的存在或不存在，而且取决于其丰度。

不同于PCR的其他核酸扩增法

PCR一词经常与“核酸扩增”同义使用，证明了其具有开创性。然而我们必须强调，其他核酸扩增试验（NAATs）已经被开发出来，不同于PCR，它们的反应过程通常是不需要变温循环的等温法。我们注意到有几种方法已被纳入流行的商业平台，并得到广泛传播。这些方法包括环路介导的等温扩增、核酸内切酶扩增反应、转录介导的扩增和螺旋酶链反应等温技术的理论优势在于其简化的仪器，在某些情况下比快速循环PCR更受到欢迎。  

微生物核酸扩增试验的常见应用

经过40多年的改革，PCR和其他NAATs的出现极大地提高了临床实验室的能力，改变了“标准”诊断的定义。NAATs已经成为指导住院和门诊病人感染诊断的一个常见的综合组成部分。

分子诊断对更容易培养的细菌和真菌的作用更难用单一的、广泛的方式来描述。对于这些微生物，NAATs与非分子测试的相对价值哪个更高取决于具体的生物体和感染的解剖部位。但总的来说，尽管目前已经开发了许多分子检测方法，但仍需要以更快或更直接的方式来提供与常规细菌/真菌培养相似的数据。快速PCR的阳性结果允许临床医生实时确定结核病的诊断，甚至根据耐药性的可能性调整治疗。后者是Cepheid Xpert MTB/Rif检测的基础，它帮助发展中国家普及了分子诊断技术。来源于同一测试的阴性结果，特别是在多次重复均为阴性的情况，感染预防专家也可以利用它来预测患者感染结核病的可能性较低，从而终止预防空气传播的措施。

现在一些商用的qPCR平台可以实现对许多病原体的检测，这些平台已经在美国FDA进行了试验并被正式批准使用，通常校准可追溯到世界卫生组织（WHO）的国际单位标准。这些流程在执行测试的各个实验室之间提供了一定程度的质量保证和数据标准化。众所周知，样本中的病毒载量在不同的qPCR批次的试验之间可能存在显着差异，所以必须明确验证测定间的可重复性和可互换性。值得再次强调的是，这些检测通常是LDT，没有现成的FDA批准的方法。所以，在比较此类测试之间的定量值或对外公布的数据时需要谨慎。  

测序技术在微生物诊断中的应用

虽然NAATs仍然是临床微生物实验室中最常见的分子工具，但病原体的基因序列也可以提供有价值的数据。因此，诊断测序在感染治疗中发挥着越来越重要的作用。测序技术正飞速发展，该技术已经扩展到链终止方法之外的领域，包括同时表征数百万/数十亿读数的二代测序（NGS）。包括二代短序列方法（例如Illumina、Ion Torrent）和三代长序列技术（例如PacBio、Oxford Nanopore）。

测序可以用来表征直接从临床标本中提纯的微生物DNA/RNA，和从培养中已经分离的单个菌株中提取的微生物DNA/RNA。例如，细菌/真菌的鉴定主要是通过替代方法来进行的。但分类学的基础还是在于DNA。当替代的方法难以满足时，对微生物管家基因的测序可提供更高的标准。各种位点的菌种级别的测序也可以在追踪疫情方面发挥重要作用，因为它能够衡量菌株之间的相关性或克隆性。鉴于NGS的出现，基于全基因组测序（WGS）的检测方法在定义疫情和描述病原体流行病学方面发挥着越来越大的作用，这在公共卫生实验室显得尤为重要。

此外，测序可以在各菌株之间的水平上评估一个生物体的相关临床表型，包括指导抗菌疗法。它对生长特性具有挑战性的病原体特别有价值。HIV是一个公认的例子。HIV的蛋白酶、逆转录酶和整合酶位点具有多态性，这种多态性与逆转录病毒的耐药性相关。一般来说，由于病毒的基因组较小，是抗菌药物基因分型的理想靶标。对于细菌和真菌，WGS同样为培养的分离物或未培养标本的肿瘤抗菌谱提供了可能。值得注意的是，为了给疾病的诊断建立相互关系，运用多位点和机器学习模型预测WGS数据的抗菌素敏感性已越来越普遍。

分子检测不一定分为扩增/检测和基于序列的特征分析。随着科技的发展，可以利用测序来检测临床样本中病原体的存在，同时确定其特征。在各种不同的情况下，这种策略被描述为广义的检测、不确定的检测和诊断性的宏基因组学。

更进一步说，从临床标本中提取的核酸可以直接进行基于NGS的深度测序。尽管大多数基因拷贝数来自于宿主，但如果只有一小部分与病原体有关，那么即可表明NGS所发挥的病原学诊断作用。血浆是宏基因组分析中另一个重要标本类型。微生物基因组拷贝数往往反映了机体内的感染病灶有无通过细胞外空间进入循环的游离核酸。因此，血液中没有活的或完整的循环生物体，但能检测到低水平的微生物DNA/RNA的可能性是存在的。当然，这些检测方法的开发、质量保证和报告可能比其他分子诊断法要复杂得多，特别是在参考标准、对照、微生物定量和序列数据库的验证方面。从条件致病菌中分辨出共生或短暂的菌群（甚至是背景信号）也是一个挑战。由于技术的新颖性和数据的个性化带来挑战，对宏基因组数据的临床解释仍需谨慎。

图2 （A）分子诊断的综合主题。指导分子诊断应用于感染性疾病护理的关联因素网络。这里提供的例子包括诊断技术本身的进步和我们对感染和宿主-微生物相互作用的病理学理解；实验室和诊所在实践和后勤中的注意事项；卫生保健资金和赔偿中的重要事项；以及世界各地围绕诊断检测的监管/法律框架。（B）NAAT技术的发展。经许可转载自参考文献159。POCT即床旁检测。

分子诊断中的突出主题

商业分子平台的设计越来越强调自动化和样本到结果的能力，类似于基于培养的诊断微生物学中实验室的全面自动化。在这里，自动化液体处理平台可以将核酸提取与扩增、检测甚至报告相结合，最大限度地减少了直接操作样本的需求。

对分子诊断的简单性的需求远远超出了实验室本身。希望在床旁（POC） 实施分子检测是最值得注意的趋势之一，包括诊所和紧急护理场所。POC诊断可以促进针对性治疗，防止不必要的治疗，并推动感染预防工作。分子POC检测比传统的免疫分析更具有优势，特别是敏感性和阴性预测值得到了提高。相反，分子POC检测阴性可以作为这些药剂的一种排除条件，消除了经验治疗的必要，而后续结果待定。

对于POC工具而言，操作的简单性甚至比包括获得监管批准在内的其他条件更重要。低复杂性是至关重要的，因为作为最终用户的临床医生往往没有接受过分子技术或诊断质量监测方面的正式培训。近年来就推出了几项针对呼吸道病原体的分子POC检测，以及首个针对性传播感染的此类平台，预计分子POC检测的范围只会扩大。

当然，如果不解决高复合症候群检测的出现，任何关于感染性疾病分子检测的讨论都是不完整的。对于各种感染，鉴别诊断可能包括许多无法通过临床鉴别的病原体，相反，需要对每种微生物进行平行检测。迅速获得这一信息可以促进针对性的护理升级和降级，促进抗菌药物管理。

虽然多重平台具有强大的分析能力，但它们的实施并非没有挑战。事实上，所有分子检测的一个关键限制是，检测（本身）不能区分出活病原体的核酸和解决/治疗感染的“分子残留物”。类似的挑战涉及区分感染与无症状定植。在解释任何分子数据时，这种潜在的模糊性是固有的，但在同时检测到许多指标时，和在预测概率高的患者中是非常相关的。同样，作为初步诊断检测而开发的试验并不总是适合作为治疗的分子检测，这一动态因COVID-19而显著，并希望利用阴性随访结果通知接触限制。矛盾的是，这种检测的高分析灵敏度可能会降低它们辨别已解决的感染的能力。

即使多重检测的临床解释是毫无疑问的，围绕临床可操作性、正确使用和诊断管理的其他问题也会出现。

回到检测的分析维度，人们必须认识到，感染性疾病的分子分析应该超出核酸的范畴。广义上，分子诊断不仅包括基因组学，还包括代谢组学、转录组学和蛋白质组学技术。事实上，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱，蛋白质组学在细菌/真菌鉴定中的广泛应用证明了蛋白质组学技术的力量。

最后，无论是成熟的技术还是新兴的技术，都必须考虑不断变化的法律/监管要求的影响。在任何地方，诊断监管的现状都不是一成不变的。虽然这些变化并不局限于感染性疾病的治疗，但鉴于分子检测现在的普遍作用，这一领域可能是受影响最深刻的领域之一。  

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

原文以《感染性疾病分子诊断技术40年的变化》为题发表在《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「专题笔谈」版块

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