本发明属于生物，涉及一种月季细胞的快速悬浮培养和高效遗传转化方法。

背景技术：

1、月季是蔷薇科蔷薇属植物，是世界范围内最重要的观赏作物之一，广泛应用于切花、盆花、庭院绿化以及道路美化等方面，应用历史超过5000年。我国作为世界蔷薇属植物的分布中心，产自我国的‘月月粉’和‘香水月季’等种质所携带的连续开花以及香味等重要性状在现代月季的育成中起到了至关重要的作用。

2、月季切花是世界切花之首，我国是世界月季生产面积最大的国家，2020年，月季产值达200亿元。月季基因组较小，2倍体古老品种‘月月粉’dna含量约为1.2pg/2c，约为模式植物拟南芥(0.3pg/2c)的4倍。现代月季童期短，基因型世代仅约一年；月季植株可以反复开花，并且修剪后新萌发的枝条约40天就可开花，与模式植物拟南芥的生长周期相近。月季具有极为丰富的花型、花色和花香等在其他模式植物中无法研究的独特性状，而这些丰富的表型变异，结合现代组学工具，可较为方便地建立起基因位点和表型的关联。月季花朵尺寸较大，便于观察；大多数基因型容易进行无性繁殖，扦插后约40-50d即可开花，便于在短期内获得大量的一致性材料。特别是现代月季多为重瓣花型，花瓣结构相对均一，生命周期短，且可在不造成实质性损伤的情况下进行多种处理。因此，月季可被作为观赏植物研究的模式植物。

3、基因修饰广泛用于分子研究和作物育种。然而，月季作为木本植物，不仅遗传转化周期较长，约8-10个月，而且遗传转化效率低。遗传转化周期长和遗传转化效率低严重影响了月季基因功能研究和分子育种工作，因此，亟需开发一个快速高效的遗传转化和验证系统来提高月季遗传转化的效率，降低稳定转化失败的风险。

4、目前，月季的遗传转化主要是采用农杆菌介导的愈伤组织转化法。然而，愈伤组织作为遗传转化材料，存在着转化效率低的问题。植物的悬浮细胞由于具有良好的分散性、均一性，而且细胞增殖快，是进行遗传转化的良好材料。甘薯、水稻、烟草和杨树等多个作物上都已报道建立了高效的悬浮细胞遗传转化体系，而月季悬浮细胞系的建立和遗传转化目前尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种月季细胞的快速悬浮培养方法，以及一种月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，以解决现有技术尚未建立月季悬浮细胞遗传转化体系，以月季愈伤组织作为遗传转化材料存在的转化效率低的问题，为通过月季细胞培养快速进行基因功能验证、亚细胞定位和验证蛋白互作等提供有效途径，同时为基因工程改造月季奠定基础。

2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种月季细胞的快速悬浮培养方法，包括以下步骤：

4、(1)愈伤组织的诱导：选取月季幼嫩叶片，将选取的月季幼嫩叶片接种到诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养；将诱导的愈伤组织转移至增殖培养基中，进行增殖培养；

5、(2)悬浮细胞的制备：选取步骤1)增殖培养1个月的愈伤组织；将选取的愈伤组织接种到无凝胶的增殖培养基中；将该培养基置于恒温震荡培养箱中进行培养，获得稳定的初代悬浮细胞；

6、(3)悬浮细胞的继代培养：选取步骤2)获得的稳定初代悬浮细胞再接种于无凝胶的增殖培养基上；将接种悬浮细胞的无凝胶增殖培养基置于恒温震荡培养箱中培养，进而获得继代培养的月季悬浮细胞；

7、(4)继代培养悬浮细胞的保存：对步骤3)获得的含有继代培养的月季悬浮细胞的无凝胶增殖培养基进行过滤，获得继代培养的月季悬浮细胞，取该细胞置于含凝胶的增殖培养基上进行继代保存。

8、进一步地，上述诱导培养基成分包括4.40g·l-1-4.45g·l-1ms salt、2.5mg·l-1-3.5mg·l-1 2,4-d、0.05mg·l-1kt、30g·l-1glucose、0.3％gel。

9、进一步地，上述增殖培养基包括4.40g·l-1-4.45g·l-1ms salt、0.8mg·l-1-1.2mg·l-12,4-d、0.8mg·l-1-1.2mg·l-1 6-ba、6％glucose、0.3％gel。

10、进一步地，上述愈伤组织诱导培养的条件是25℃，黑暗条件下，时间是2周；所述增殖培养的条件是25℃，黑暗条件下。

11、进一步地，悬浮细胞的制备中的培养条件是25℃，黑暗条件下，130rpm/min震荡培养，每周更换一次培养基，持续4至8周，每周清除大块愈伤。

12、以上述月季细胞的快速悬浮培养方法的技术方案为基础，本发明还提供了一种月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，该方法以上述月季细胞的快速悬浮培养方法培养得到的月季悬浮细胞作为转化材料，利用质粒转化的农杆菌菌株对转化材料进行侵染，然后筛选培养，获得成功转化的月季悬浮细胞。

13、上述月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，包括以下步骤：

14、(1)载体转化农杆菌：将质粒转化到农杆菌菌株中，挑选转化成功的单菌落，接种于lb液体培养基中培养，离心去除上清液，收集阳性农杆菌；

15、(2)用ms重悬溶液浸泡上述离心收集的阳性农杆菌，从而获得侵染液；

16、(3)过滤并收集上述继代培养的月季悬浮细胞；

17、(4)将步骤3)月季悬浮细胞置于步骤2)的侵染液中进行侵染，获得已转染的悬浮细胞；

18、(5)共培养：取步骤4)已转染的悬浮细胞，置于共培养培养基中共培养；

19、(6)筛选培养：取步骤5)共培养结束的悬浮细胞，置于选择增殖培养基中进行选择培养，获得月季悬浮细胞团。

20、进一步地，步骤2)所述ms重悬溶液包括4.40g·l-1-4.45g·l-1ms salt、8mm-12mmmes、8mm-12mm mgcl2、3％glucose、180μm-220μm as。

21、进一步地，步骤5)所述共培养培养基的成分包括4.40g·l-1-4.45g·l-1ms salt、0.8mg·l-1-1.2mg·l-1 2,4-d、0.8mg·l-1-1.2mg·l-1 6-ba、4.5％glucose、0.3％gel。

22、进一步地，步骤6)所述选择增殖培养基的成分包括4.40g·l-1-4.45g·l-1mssalt、0.8mg·l-1-1.2mg·l-1 2,4-d、0.8mg·l-1-1.2mg·l-1 6-ba、4.5％glucose、0.3％gel、280mg·l-1-300mg·l-1cef、8mg·l-1-12mg·l-1hygromyci。

23、进一步地，步骤4)所述质粒为pcambia1300；所述农杆菌为eha105。

24、有益效果：

25、1、本发明建立了月季细胞的快速悬浮培养方法，通过该方法的愈伤组织诱导条件能高效诱导出月季愈伤组织，得到的月季愈伤组织具有生长旺盛、不褐化等特点，可长期继代保存，对所得月季愈伤组织进行悬浮培养，能在14d快速获得大量的月季悬浮细胞。

26、2、以本发明建立的月季细胞的快速悬浮培养方法为基础，本发明还提供了月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，该方法能高效转化月季细胞，可用于研究月季生长发育及分化的机制和遗传变异规律。

27、3、本发明建立了月季细胞的快速悬浮培养方法和高效的遗传转化方法，不仅周期短，而且遗传转化效率高，解决了月季本体无法实现过表达蛋白的问题，筛选14d可获得稳定转化的悬浮细胞系；还可快速实现在月季本体进行基因功能验证、亚细胞定位、蛋白表达、合成生物学研究等，从而可加快加深对月季花色、花香、衰老、胁迫等方面的研究。