DYCZ-40D转移槽、DYY-7C电泳仪、WD-9413B型凝胶成像系统（北京六一仪器厂）；DYCZ-24DN双垂直蛋白电泳仪、NW10LVF超纯水系统［力康生物科技（香港）控股有限公司］；H-2050R超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；ELX-800酶标仪（美国伯滕仪器有限公司）；JT-12S型组织自动脱水机、JB-L5型石蜡包埋机、JK-6型生物组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型石蜡切片机（德国Leica公司）；Eclipse Ci-L型显微镜［尼康仪器（上海）有限公司］；HC-3018型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.3药品与试剂

盐酸异丙肾上腺素（ISO，批号：P172260，美国Sigma公司）；复方丹参滴丸（批号：202012，天津天士力制药股份有限公司）；戊巴比妥钠（批号：57-33-0，德国Merck公司）；无水乙醇（批号：64-17-5，西陇科学股份有限公司）；苏木素（批号：517-28-2，北京索莱宝生物科技有限公司）；曙红Y，醇溶（批号：15086-94-9，山东西亚化学科技有限公司）；全蛋白提取试剂盒（批号：WLA019）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：WLA004）、一抗二抗去除液（批号：WLA007）、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号：WLA013）、Western洗涤液（批号：WLA025）、SDS-PAGE电泳液（干粉，批号：WLA026）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号：WLA005）、ECL发光液（批号：WLA003）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）抗体（批号：WL03694）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（批号：WL02477）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体（批号：WL01607）、磷酸化转录激活蛋白3（p-STAT3）抗体（批号：WLP2412）、转录激活蛋白3（STAT3）抗体（批号：WL03207）、血管内皮生长因子A（VEGFA）（批号：WL00009b）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）抗体（批号：WL02664）、血小板衍生生长因子A（PDGFA）抗体（批号：WL02880）、HRP标记的羊抗兔IgG抗体（批号：WLA023）、β-actin抗体（批号：WL01845）均购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.4实验动物

SPF级SD雄性大鼠，体质量220～250 g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030。在温度为24～27 ℃，湿度40%～60%的环境下饲养，照明适度，食物和水充足。动物实验操作在陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准下进行（批准号SUCMDL-20190309001）。

2方法

2.1网络药理学分析

2.1.1丹参-红花药对活性成分筛选及靶点预测通过检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和文献手动补充获得丹参-红花药对的有效化学成分及对应的蛋白质靶点，筛选标准：口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18［11］。使用Uniport（https：//www.uniprot.org）蛋白质数据库对筛选得到的对应靶点进行基因名标准化处理。

2.1.2丹参-红花药对治疗心肌缺血相关靶点筛选以“心肌缺血”及“急性心肌缺血”为关键词，在CTD（http：//ctdbase.org/）、DisGeNET（https：//w-ww.disgenet.org/search）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库中检索疾病的潜在靶点。汇总上述收集到的靶点，去掉重复靶点，得到心肌缺血潜在靶点。利用Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/i-ndex.html）将筛选得到的有效化学成分靶点与疾病靶点进行交集并绘制韦恩图，即为丹参-红花药对治疗心肌缺血的作用靶点。

2.1.3活性成分-靶点网络及蛋白质相互作用网络（PPI）构建将交集靶点信息上传至STRING v11.0 （https：//string-db.org），物种设定为“Homo sapiens”，设定相互作用阈值＞0.9，将生成的数据导入Cytoscape 3.6.1软件中构建活性成分-靶点网络及PPI网络，并选择度值筛选靶点，进行拓扑分析。

2.1.4富集分析通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）对丹参-红花治疗心肌缺血的靶点进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析。以P＜0.05作为筛选标准，识别具有显著性意义的生物学进程和信号通路。

2.2动物实验

2.2.1药液的制备取丹参900 g、红花300 g，加入8倍量水在室温下浸泡1 h，45 ℃浸泡提取3次，每次2 h，滤过，滤液合并减压浓缩至含生药1.6 g·mL-1浓缩液（丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的质量分数分别为4.65、17.10、1.82、4.62、55.20 mg·g-1），4 ℃冰箱冷藏备用。

2.2.2实验动物分组与给药40 只SD雄性大鼠，喂养1周后，根据体质量随机分成4组，每组10只，即对照组、模型组、复方丹参滴丸（73 mg·kg-1·d-1）组、丹参-红花（生药量16 g·kg-1·d-1，课题组筛选出的最佳疗效剂量 ［ 12］）组。对照组和模型组大鼠每天ig等量0.9%氯化钠溶液，体积10 mL·kg-1，给药组ig相应剂量的药物，每天1次，共7 d。于第6天，除对照组外，其余各组给药1 h后sc ISO（85 mg·kg-1），连续2 d造模。

2.2.3样本采集末次注射ISO 12 h后，大鼠ip 2%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉后进行腹主动脉取血。取心脏用0.9%氯化钠溶液冲洗血渍，一部分浸泡固定在10%中性福尔马林溶液中，用于组织病理学观察；剩余部分-80 ℃冻存，用于蛋白免疫印迹检测。

2.2.4心肌组织病理学观察取出固定的心肌组织，自来水冲洗，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE染色，封片。在显微镜下观察心肌组织病理变化。

2.2.5蛋白免疫印迹检测取一定量冻存的各组大鼠心肌组织，液氮研磨，加入裂解液，在4 ℃，12 000 r·min-1条件下离心20 min，吸取上清液提取蛋白，采用BCA法测定蛋白质量浓度。以β-actin作为内参抗体，在胶板的上样孔进行电泳，切下目的蛋白条带胶块转至PVDF膜，加入5%的脱脂奶粉密封2 h，分别加入p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、HIF-1α、VEGFA、bFGF、PDGFA抗体，孵育过夜。冲洗PVDF膜3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体孵育，根据显影定影试剂盒说明书准备显影液和定影液，扫描胶片，运用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的灰度值。

2.3数据统计与分析

数据分析应用GraphPad Prism 8统计软件，实验数据以表示，多组数据通过单因素方差分析及统计比较各组间的差异，两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3结果

3.1网络药理学的分析结果

3.1.1丹参-红花药对活性成分及靶点通过TCMSP数据库筛选并结合文献补充，得到丹参-红花药对的活性成分91个，其中丹参68个，红花19个，丹参与红花共有成分4个，具体成分信息见表1。通过TCMSP数据库收集及经过Uniprot数据库规范化处理，91个活性成分共识别到886个潜在靶点。

3.1.2丹参-红花药对治疗心肌缺血靶点的识别丹参-红花药对治疗心肌缺血的靶点经GenesCards数据库、DisGeNet数据库、CTD数据库和NCBI数据库收集，删除重复靶点后，得到957个心肌缺血靶点。与丹参-红花药对活性成分对应的靶点进行交集得到246个潜在作用靶点，见图1。

3.1.3活性成分-靶点网络构建丹参-红花活性成分-靶点网络，此网络包含332个节点（88个活性成分节点和246个靶标节点）和1 823条边，见图2。在该网络中，节点代表活性成分或心肌缺血的治疗靶点，节点间的连线表示靶点间潜在的关系。该网络显示多个心肌缺血靶点可以被丹参-红花药对中同一个活性成分作用，多个活性成分也共享同一个心肌缺血靶点，证明了丹参-红花药对多成分、多靶点作用的特性。

3.1.4PPI网络将246个潜在治疗心肌缺血靶点上传至STRING数据库，排除了置信度小于0.9的靶点，构建PPI网络，见图3。对PPI网络进行拓扑分析，见图4，前20个枢纽靶点主要包括STAT3、MAPK1、JUN、RELA、MAPK3、AKT1、SRC、APP、TNF、PIK3CA、CXCL8、KNG1、IL6、VEGFA、MAPK14、HSP90AA1、MAPK8、EGFR、FOS和IL2。从结果可以推断，这些枢纽靶点在网络中具有较强的相互作用，可能是丹参-红花抗心肌缺血的核心靶点。核心靶点的具体拓扑参数见表2。

3.1.5GO和KEGG通路富集分析GO分析取前20条进行可视化处理，见图5。其中生物过程（BP）涉及对缺氧的反应、对凋亡过程的负调节、对脂多糖的反应及血管生成的正调控等。细胞组分（CC）涉及细胞外空间、细胞表面、细胞质、质膜和细胞外基质等。分子功能（MF）涉及与蛋白质结合、受体结合、酶结合、细胞因子活性、生长因子活性等。由此表明丹参-红花药对通过多个生物过程治疗心肌缺血。KEGG分析，挑选出P值排名前20显著的信号通路进行可视化处理，见图6。这些重要的KEGG信号通路主要涉及血管生成（如HIF-1信号通路和VEGF信号通路）、炎症反应（如NF-κB信号通路和TNF信号通路）、细胞凋亡（如细胞凋亡信号通路和p53信号通路）和信号转导（如MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Jak-STAT信号通路）。因此，进行动物实验，通过蛋白免疫印迹法检测丹参-红花药对血管生成相关的蛋白表达的影响。

3.2动物实验验证结果

3.2.1丹参-红花对急性心肌缺血大鼠心肌病理改变的影响如图7所示，对照组大鼠心肌细胞正常，心肌细胞横纹清晰，少有炎细胞浸润；模型组大鼠心肌纤维肿胀且有断裂，心肌细胞增宽，细胞浆聚集呈颗粒状或溶解呈空泡状，细胞核增大变圆；局部有明显水肿、渗出、炎性细胞浸润，表明模型建立成功。复方丹参滴丸组与模型组大鼠比较，心肌纤维排列略微紊乱且较窄，而肌纤维排列紧密，病理改变程度有所减轻。丹参-红花组大鼠的心肌纤维排列整齐，细胞形态结构完整，心肌纤维肿胀轻，无毛细血管扩张，细胞核清晰，居中，接近正常心肌形态。

3.2.2丹参-红花对急性心肌缺血大鼠心肌组织中血管生成相关蛋白表达的影响如图8、9所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中HIF-1α、VEGFA、PDGFA和bFGF的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），p-mTOR和p-STAT3的蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，丹参-红花显著上调了p-mTOR、p-STAT3、HIF-1α、VEGFA、PDGFA和bFGF的蛋白表达水平（P＜0.05、0.01）。

4讨论

随着社会的发展，人们生活生平的提高，心肌缺血的发病率呈上升趋势，严重影响患者的心理健康及生活质量，因此需要对心肌缺血的治疗进行深入的研究 ［ 13-14］。在中医理论中，丹参-红花是常用的活血化瘀相须药对，两者配伍治疗心肌缺血比单独使用丹参或者红花更有效 ［ 15］。因此，有必要确定丹参-红花治疗心肌缺血的作用机制。

本研究通过网络药理学 ［ 16］构建药物-成分-靶点-疾病互作网络，从整体水平对丹参-红花药对治疗心肌缺血作用机制进行探究。筛选出丹参-红花药对中91个活性成分和246个抗心肌缺血靶点，表明丹参-红花治疗心肌缺血具有多组分、多靶点的特点。通过构建PPI网络，发现丹参-红花治疗心肌缺血可能作用于STAT3、AKT1、IL6和TNF-α等关键靶点。为探究丹参-红花药对治疗心肌缺血的潜在作用机制，进行了GO功能和KEGG通路富集分析，并通过动物实验，采用蛋白免疫印迹法检测与血管生成相关蛋白在急性心肌缺血模型大鼠心肌组织中的表达水平，验证丹参-红花是否通过调节血管生成的相关蛋白从而发挥治疗心肌缺血作用。血管生成是在已有血管的基础上形成新的血管，由促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡决定 ［ 17-18］。机体本身有自我调节功能，当发生心肌缺血时会产生血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等 ［ 19-20］，促进缺血心肌周围的血管生成，增加血液供给。STAT3作为关键靶点，研究表明激活STAT3可上调VEGF的表达和血管生成 ［ 21］。当心肌细胞难以摄取足够的氧气导致缺氧时，mTOR被激活进一步调控HIF-1α增多并表达 ［ 22-23］，进而上调VEGFA、bFGF和PDGFA的表达，促进血管生成 ［ 24-25］。但机体自我调节相对有限，无法构建很多侧支循环来支持血液供应。如果血管生长因子及相关受体能够在药物的作用下提高表达，新生血管就会加快生成，进而构建有效的侧支循环满足心脏的供血，即治疗性血管生成 ［ 26］。研究表明，治疗性血管生成在各种缺血性病理环境中起着至关重要的作用，包括心肌梗死、缺血/再灌注损伤、脑缺血 ［ 27-30］。因此，治疗性血管生成已成为缺血性心脏病的一种有吸引力的新型治疗策略 ［ 31］。

HE染色结果表明丹参-红花药对可缓解心肌缺血大鼠心脏组织病理变化，改善炎细胞浸润。基于网络药理学分析结果，通过蛋白印迹法对血管生成的相关蛋白进行验证，结果显示，与模型组相比，丹参-红花显著地升高p-mTOR、p-STAT3、HIF-1α、VEGFA、PDGFA和bFGF的表达水平，提示丹参-红花可通过上调这些与血管生成相关的蛋白水平来促进急性心肌缺血大鼠缺血心肌组织的血管生成，从而改善其缺血性损伤。

本研究通过网络药理学和动物实验结合，揭示丹参-红花药对治疗心肌缺血的作用机制，为中药治疗心血管疾病提供新的策略和研究思路。由于丹参-红花药对治疗心肌缺血多靶点、多通路的特性，中药活性成分的复杂性，仍需进一步研究丹参-红花药对治疗心肌缺血的调控机制，为治疗心血管疾病的新药研发提供基础和依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：薛志鹏，杜少兵，周慧慧，李菁，孟祎，白吉庆，王小平．基于网络药理学和实验验证的丹参-红花药对治疗心肌缺血的作用机制探讨 [J]. 药物评价研究, 2023, 46(4): 759-771 .返回搜狐，查看更多