微藻利用光合作用将二氧化碳转化成碳氢化合物, 获得藻细胞所需养分、维持生长和增殖, 而其光合作用则依赖于叶绿体膜上的两个光反应系统(光系统Ⅰ和光系统Ⅱ).早在20世纪30年代, Hopkins[1]的研究首先证明了微量元素锰是浮游植物生长的必需微量营养元素之一.后续的研究进一步证明锰参与光系统的构成.在每个光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ, PS Ⅱ)的反应中心均有4个锰原子, 一部分锰可在电荷积累中起直接作用, 其余部分则作为OEC的结构因子[2].微量元素锰除了参与光系统构成外, 也是叶绿素合成过程中以及自由基清除酶促反应中的辅助因子, 常常以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的形式存在, 例如, 硅藻纲中存在活跃的含锰超氧化物歧化酶Mn-SOD[3]. SOD可以降低活性氧(reactive oxygen species, ROS)对细胞的损伤, 维护叶绿体膜结构.锰对微藻生长也有重要的作用, 锰缺乏会影响叶绿素合成, 造成光系统功能缺陷, 降低PS Ⅱ活性、半乳糖甘油二酯(galactosyl diglyceride)含量以及乙醇酸(glycolate)的合成等[4, 5].一些研究还发现锰和赤潮的形成及暴发紧密相关[6, 7], 锰浓度的变化甚至还影响微藻的油脂积累[8].

叶绿素荧光诱导动力学分析技术利用光合生物体内叶绿素荧光作为天然探针, 可以无损、快速灵敏地研究光合作用动力学过程, 评价PS Ⅱ光能捕获、电子传递和光能损耗等过程的效率和特点[9].这些优点使得该技术也被用来研究逆境对微藻或植物的胁迫作用, 如金属、环境污染物、高温等[10~12].现有关于锰对光合作用影响的研究大多集中在高等植物中, 如缺锰会影响玉米PS Ⅱ的功能[13].除个别研究外[14], 应用该技术探究锰对微藻光合机制影响的研究还很少.

本研究利用叶绿素荧光诱导动力学分析技术, 分析锰添加对威氏海链藻生长、叶绿素荧光特性以及ROS的影响; 通过PS Ⅱ供体侧和受体侧, 揭示锰在微藻光合作用动力学过程中的影响和作用, 以期为探讨其与ROS的关系提供参考依据.

本实验用威氏海链藻Conticribra weissflogii(C. weissflogii, CCMP1587)是一种海洋模式硅藻, 采用f/2培养基[15]对其进行保种并扩大培养.氯化锰MnCl2·4H2O(Sigma M3634), 用超纯水配制成900 mmol·L-1的母液存于4℃冰箱中待用.

本实验以不添加锰的f/2培养基(f/2-Mn)为基础, 进行不同锰浓度(0、9、90、900、9 000 nmol·L-1 MnCl2·4H2O)的培养实验, 每组处理3个平行样, 其中设0 nmol·L-1 Mn为对照组.实验用海水取自深圳大亚湾, 经过0.22 μm孔径的滤膜2次过滤后使用, pH 8.1, 盐度33‰, 培养温度20℃, 光照周期L：D为14 h：10 h, 光照度为4 000~5 000 lx.实验培养用1 L的Nalgene聚碳酸酯瓶, 培养藻液体积为800 mL, 每天摇动培养瓶2~3次并随机调换培养瓶位置.取培养至稳定期的藻细胞离心悬浮至添加不同锰浓度的培养基中, 培养8 d, 每天定时取样进行细胞生长、叶绿素荧光参数和ROS的测试.各指标的测定及计算结果取3个平行样的平均值.

微藻细胞密度和750 nm光密度具有很好的线性关系[16], 采用UV-分光光度计(UV-1780, SHIMADZU)测定藻细胞在750 nm处的光密度(optical density, D750), 表征威氏海链藻的生长状况.根据D750计算藻细胞的生长速率, 计算公式为：

式中, Nt表示t时D750; Nt+1表示在t+1时D750; T(d)表示两个时间点的间隔.

叶绿素荧光参数采用双调制荧光仪(PSI, Czech Republic)进行JIP-测定[9], 记录荧光瞬变的时间为1 s, 最初2 ms每10 μs记录1次, 之后每1 ms记录1次.取2 mL经暗适应15 min后的样品用荧光仪测定, 获得快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP荧光曲线).

OJIP荧光曲线反映了暗适应后的样品暴露在光下时, 由最低荧光O点经历两个荧光拐点J点和I点, 到达荧光最高峰P点的荧光过程[9], 主要参数包括：F0, 在50 μs测定所得的初始荧光值; Fk, 在300 μs测定所得的荧光值; FJ和FI分别是J点(2 ms处)和I点(20 ms处)的荧光值; Fm, 所有反应中心都关闭时即P点处的最大荧光值.叶绿素荧光诱导动力学过程主要参数的计算公式和意义如表 1所示，其中所有的参数都经过对照组标准化, 计算结果是对照组的百分比.

采用荧光染剂2, 7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H2DCFDA, Sigma, D6883)测定藻细胞内的ROS含量[18].荧光染剂用二甲基亚砜配制成10 mmol·L-1母液置于-20℃冰箱备用, 用2次过滤后的海水将母液配制成工作溶液, 现配现用.样品加染剂后, 黑暗条件下孵育60 min(染剂最终浓度为10 μmol·L-1); 孵育后的样品经清洗3次后, 用酶标仪测定荧光强度(Ex=488 nm, Em=525 nm; TECAN, M200 PRO).测得的荧光值除以该样品的D750, 得到的标准化荧光值作为活性氧指数.

本实验数据用Excel 2016和OriginPro 2017作图, 用IBM SPSS Statistics 22进行统计分析.组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 若方差齐采用LSD法, 若方差不齐采用Tamhane's T2法进行多重比较及相关性分析, P＜0.05则表示差异显著; 二元变量相关分析采用Pearson相关系数法.

锰浓度对威氏海链藻生长曲线和生长速率的影响如图 1所示.不同处理组的藻细胞在培养初期均呈指数生长, 第3 d稳定期后, 最高浓度锰(9 000 nmol·L-1)的细胞光密度和生长速率均显著高于对照组(P＜0.05), 而其它锰浓度与对照组之间均无显著差异(P＞0.05).

锰浓度对威氏海链藻OJIP荧光曲线的影响如图 2所示.由威氏海链藻的生长曲线[图 1(a)]可知, 第2、4、7 d时, 藻细胞分别处在指数期、稳定前期和稳定中期, 因此主要选取了这3个具有代表性的生长阶段, 对其进行叶绿素荧光的分析.培养初期, 藻细胞光合作用较弱, 荧光曲线趋于一条直线, 不同锰浓度下的OJIP荧光曲线未呈现差别.第2、4、7 d时, 90 nmol·L-1 Mn处理组的OJIP曲线荧光强度最高; ≤90 nmol·L-1 Mn各组的荧光曲线强度随锰浓度的升高而上升; ≥90 nmol·L-1 Mn各组的荧光曲线强度在第2 d随锰浓度的升高而下降, 在第4、7 d则无明显差别.

从0 nmol·L-1 Mn处理组的荧光曲线可以观察到“K相”的出现, 随着时间的推移“K相”越明显, 如图 3给出了第7 d时, 0 nmol·L-1 Mn与9 000 nmol·L-1 Mn两个处理组OJIP荧光曲线对比的“K相”图(“K相”指的是在J点之前, 大约在300 μs处出现的一个特征阶段).

锰浓度对威氏海链藻叶绿素荧光参数的影响如图 4所示, 锰添加对各荧光参数的影响随培养时间的增加而增强.图中F0(初始荧光), 是初始单位受光截面的光子通量(ABS/CS0), 也表征藻细胞的叶绿素浓度[19].第7 d时, 9000 nmol·L-1 Mn显著降低了F0(P＜0.05), 而其余锰浓度对F0的影响不显著(P＞0.05).

锰添加的所有浓度均提高了PS Ⅱ活性反应中心的密度(RC/CS0), 且促进作用随培养时间的增加逐渐增强.其中90 nmol·L-1 Mn的促进作用最大, 增幅高达20%(P＜0.05).

本实验结果表明, 锰浓度对相对可变荧光(VJ)没有显著性影响(P＞0.05).但是锰添加降低了藻细胞荧光上升的初始斜率(M0), 尤其在第7 d时, 抑制作用显著且随锰浓度的增加而增强(P＜0.05).

锰添加提高了藻细胞最大光化学效率(Fv/Fm)和反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产量(φE0).第7 d时, φE0随着锰浓度的升高呈上升趋势, 且显著高于对照组(P＜0.05).锰添加还提高了用于初级醌受体QA之后电子传递链激子的比率(ψ0), 但提高程度不显著(P＞0.05).

微藻和植物光合作用过程中能量的吸收与传递主要包括4部分：①反应中心吸收光能量(ABS/RC); ②被吸收的光能, 一部分被捕获用于光合作用(TR0/RC); ③一部分以热耗散的形式消耗(DI0/RC); ④捕获的能量(TR0/RC)被进一步传递到光合电子传递链中(ET0/RC).本实验发现, 在藻细胞不同生长时期, 锰添加均显著降低了单位光合作用反应中心对光能的吸收(ABS/RC), 以及藻细胞以热耗散方式损失的能量(DI0/RC)(P＜0.05).

第7 d时, 锰添加对藻细胞光合作用能量吸收与传递过程中的4部分能量均产生了抑制作用, 且随着锰浓度的增加而逐渐增强.

各浓度锰添加均促进了威氏海链藻光能吸收性能(PIABS)和受光横截面性能(PICS), 且促进作用随培养时间的增加而增强.第2、4 d时, 90 nmol·L-1 Mn的促进作用最强; 第7 d时, 则是9 000 nmol·L-1 Mn的促进作用最强.

锰浓度对威氏海链藻ROS含量的影响如图 5所示.第2 d时, ROS含量基本随着锰添加浓度的增加而显著降低(P＜0.05);在生长稳定期(第4、7 d), 总的来说, 锰添加对ROS含量呈抑制趋势(第7 d时900~9 000 nmol·L-1 Mn除外).

本研究发现只有最高浓度9 000 nmol·L-1 Mn对威氏海链藻生长有显著促进作用(图 1), 这与莱茵藻(Chlamydomonas reinhardtii, 100~25 000 nmol·L-1 Mn)和微囊藻(Microcystins, 1 000~10 000 nmol·L-1 Mn)对锰的响应结果相近[5, 20].有些藻种仅需要低浓度锰就可以被促进生长, 尤其是赤潮藻类, 如10-3~10 nmol·L-1 Mn促进了有毒赤潮甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)生长, 900 nmol·L-1 Mn促进了塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长[7, 14].由此可见, 微量元素锰可能是触发赤潮的重要因子之一[6].

天然海水中微量元素锰浓度范围为0.05~182 nmol·L-1[21, 22], 可能仅限制某些特定微藻的生长, 如上述米氏凯伦藻、塔玛亚历山大藻等; 对于威氏海链藻、微囊藻等藻种来说, 则可能不受限制.锰添加对不同藻种生长的影响机制研究较少, 微藻对锰添加的响应机制是否与光系统结构或光合色素的组成有关也尚未清楚.

尽管除最高浓度外, 锰对威氏海链藻生长的影响不显著, 但其对光系统有显著影响.锰在PS Ⅱ的电子供体中发挥着不可缺少的作用, 每个PS Ⅱ的OEC结合4个锰原子形成的锰族, 同时可裂解2个水分子生成4个H+、1个O2分子和4个电子, 产生的电子经电子传递中间体Tyr(特殊酪氨酸分子)传递供给PS Ⅱ的反应中心.本研究发现0 nmol·L-1 Mn处理组的荧光曲线产生了“K相”. “K相”通常是由于从OEC到Tyr的电子传递过程受到抑制造成的, 而这种抑制通常是由OEC损伤所引发的[23].本研究中“K相”的出现说明锰缺失可导致OEC的合成受损, 使得威氏海链藻PS Ⅱ受体侧与供体侧之间的电子流动不平衡.电子流动的不平衡则会进一步导致PS Ⅱ反应中心被过剩电子氧化[24].因此, 低浓度锰虽然并没有显示出对威氏海链藻生长的抑制, 但和0 nmol·L-1 Mn相比较, 锰添加(9~9 000 nmol·L-1 Mn)改善了藻细胞PS Ⅱ供体侧电子传递受抑制的不平衡状况, 有利于维护威氏海链藻PS Ⅱ供体侧结构的完整性和电子传递.

OJIP荧光曲线可以反映PS Ⅱ电子受体库QA、QB及PQ库的状态[25].本研究发现, 锰添加对威氏海链藻的OJIP荧光曲线有促进作用, 有助于PS Ⅱ受体侧电子受体库容量增大; 受体容量库增大使得传递到电子传递链的电子超过QA的电子受体的概率(φE0)上升; 同时热耗散(DI0/RC)的降低以及光能转化效率(Fv/Fm)的提高, 可使被捕获的光能更多用于光化学反应, 而不是QA的还原; 而用于QA还原能量的降低, 可使QA还原(M0)减速, 进而有利于电子受体QA后的电子传递.研究还发现, 锰添加也通过增加藻细胞PS Ⅱ的活性反应中心密度(RC/CS0), 以及提高威氏海链藻光能吸收和受光横截面性能(PIABS和PICS), 来促进光合作用.总的来说, 锰添加有利于威氏海链藻PS Ⅱ受体侧的能量转化和电子传递.

叶绿素含量及活性反应中心数量直接关系到光合作用的光能转化, 适量锰的存在有利于维持和完善藻类叶绿体形状和类囊体结构, 保证正常的光合色素比例[26].本研究中, 90 nmol·L-1 Mn对活性反应中心密度(RC/CS0)的促进作用最强(P＜0.05), 对叶绿素浓度(F0)也有一定促进作用, 表明该浓度可能更有利于威氏海链藻合成叶绿素, 提高藻细胞对光能的吸收、传递和转化.曹春晖等[14]对米氏凯伦藻的研究也表明, 10 nmol·L-1 Mn最有利于该甲藻叶绿素的合成, 比本研究中锰对威氏海链藻的最适浓度低.然而, 显著促进威氏海链藻生长的9 000 nmol·L-1 Mn, 则抑制了藻细胞F0.高浓度锰可能因为抑制了叶绿素合成所必需元素Mg、Fe等的吸收, 从而阻碍叶绿素的合成[27, 28].前人对米氏凯伦藻和垂序商陆(Phytolacca americana L.)植物的研究发现[14, 29], 在高锰胁迫下其叶绿素含量也有所降低, 与本研究结果相近.

本研究发现, 锰添加提高了光合作用(图 4), 同时抑制了ROS含量(图 5), 因此对威氏海链藻叶绿素荧光与ROS的关系进行了分析, 结果如图 6、表 2所示.威氏海链藻的最大光化学效率(Fv/Fm)、光能吸收性能(PIABS)以及受光截面性能(PICS)与ROS均呈显著负相关[所有P＜0.01, 图 6(a)], 而光合作用过程中与能量吸收、传递相关的多个参数：单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、捕获的能量(TR0/RC)以及热耗散的能量(DI0/RC)均与ROS呈显著正相关[所有P＜0.01, 图 6(b)].总的来说, 锰添加降低了藻细胞的ROS含量, 影响了藻细胞光合作用的能量吸收与传递.

在光合生物体内, ROS的产生和光合作用是密不可分的.由于光合生物的光合电子传递链的各组成部分都嵌合在叶绿体类囊体膜中, 而叶绿体也同时是水裂解生成氧气的场所.叶绿体这两个过程的存在, 使得叶绿体中氧气和大量的电子不可避免会相遇, 进而产生超氧根阴离子(O2·-).超氧根阴离子通过酶促反应歧化成氧气(O2)和过氧化氢(H2O2), 最终通过金属介导的Haber-Weiss反应产生高活性的氧化物(HO·)[30, 31].所以, 即便在非胁迫状态, 光合生物的正常生理代谢过程中也会产生ROS.环境胁迫条件下, 光合生物产生的活性氧超出清除和耐受能力时, 活性氧便会对光合生物PS Ⅱ造成损伤、失活和光抑制, 影响正常的生理功能.

微藻吸收的光能, 如果无法用于光合作用、无法进入电子传递或者无法通过热耗散损失掉, 就会成为过剩能量; 这部分过剩能量, 可能以ROS的形式聚集并影响光合作用多个过程, 最终对PS Ⅱ造成损伤.对叶绿素荧光与活性氧关系的分析表明, 一方面, 威氏海链藻细胞内ROS的累积, 能造成Fv/Fm下降, 抑制光能吸收性能和光化学反应能力.另一方面, 锰添加降低了以热耗散形式损失的能量, 使被捕获的光能更多用于光合作用, 提高光能转化效率, 并降低了ROS的含量, 或提高了细胞对ROS的消除能力.

光合生物通过增强叶绿体对氧化物的抵抗力来提高对ROS的耐受能力.在这个过程中, 超氧化物歧化酶(SOD)由于能够清除细胞中多余的超氧根离子, 成为了光合生物抗氧化的重要防线[3].俞慧娜等[32]发现, 一定浓度锰可提高大豆体内活性氧的清除和抗逆能力, 促进光合作用.已有研究对威氏海链藻Mn-SOD基因进行克隆、表达和特性序列分析, 发现该Mn-SOD的存在可能降低ROS对光系统的损伤[31], 但影响Mn-SOD表达的环境因子仍缺乏研究.本研究中锰添加降低了ROS的含量, 也可能通过提高微藻合成Mn-SOD的能力, 从而提高ROS的清除能力, 降低ROS含量, 减弱其对威氏海链藻光系统的损伤, 促进光合作用反应中心将更多的能量转化并用于光化学反应.

(1) 锰添加有利于海洋微藻进行光合作用, 微量元素锰对威氏海链藻光合作用的影响大于对生长的影响, 且对光合作用的促进效果随培养时间的增加而增强.在第2、4 d, 较低浓度90 nmol·L-1 Mn对微藻的光合作用呈现了最强促进作用.

(2) 锰对威氏海链藻光合作用的促进机制, 可能通过同时影响PS Ⅱ供体侧和受体侧来实现：一方面锰添加可以促进OEC的合成, 防止“K相”的产生, 保证PS Ⅱ供体侧结构的完整性和电子传递; 另一方面, 锰添加又促进了PS Ⅱ受体侧的能量转化和电子传递.

(3) 威氏海链藻光合作用中与能量相关的荧光参数和ROS之间的显著相关关系, 揭示了ROS在锰添加促进光合作用的过程中扮演着重要角色.