细胞类型以及细胞不同的胚胎发展阶段

案例1

研究表明，在小鼠体内用cre系统引导A1基因敲除，结果显示胸腺细胞中的RNAi干扰效率明显比淋巴细胞中的干扰效率高：

1）图左表明，A1基因在小鼠体内胸腺细胞和淋巴细胞中mRNA表达水平正常化。

2）图右表明，较野生型mRNA表达量，敲减后，胸腺细胞中A1 mRNA仅剩16%，显著低于淋巴细胞细胞。

3）并且淋巴细胞中，淋巴T细胞干扰效率较淋巴B细胞好。

案例2

研究表明，在成熟T细胞中，RNAi干扰效果普遍较其它细胞低，主要是成熟淋巴细胞经历RNAi后，其细胞能力受损（不影响细胞形态和增殖能力），无法发挥干扰作用。

如图，在成熟T细胞和NIH3T3纤维细胞中分别敲减不同的基因（A1，itch，Nedd），干扰效率差距明显。

细胞内siRNA/mRNA表达水平比例

案例1

研究表明，提高mRNA表达水平，干扰效率未提高，主要受siRNA/mRNA表达水平比例限制：

如图，提高胸腺细胞中A1 mRNA表达水平约6倍，NB检测siA1干扰效率未增加，说明每个siRNA所干扰的mRNA达到饱和，所以增加mRNA表达量，干扰效率很难增加，此时增加siRNA表达量可能是提高干扰效率的唯一途径。

案例2

研究表明，在不同细胞中，即使细胞内siRNA/mRNA表达水平比例一致，干扰效率也显著不同。

如图，巨噬细胞BMDM和淋巴细胞中siRNA/mRNA表达水平比例一致时，巨噬细胞中的干扰效率显著高于淋巴细胞。

RNAi信号通路蛋白的表达水平

参与干扰信号通路的基因包括，RNA诱导沉默复合物家族蛋白（ago1-ago4），dicer，exportin-5 (XPO5)，RNA结合衰减蛋白（TRAP）

案例1

ago2能够介导RNA被剪切来实现RNA降解，导致翻译受阻，可作为RNAi发挥作用的催化引擎。并且研究数据表明提高ago2表达水平能够增强干扰效率：

1）如图，将EGFP shRNA和干扰信号通路基因（ago2、dicer、XPO5）分别共同转入HEK293细胞中，增加ago2基因表达水平显著提高shRNA的干扰效率，而其它RNAi信号通路蛋白，随着表达水平的增加对RNAi干扰效率无作用。

2）并且ago2/shRNA表达水平比例越高，干扰效率越好

案例2

RNase Ⅲ dicer是dsRNA剪切成siRNA过程中不可或缺的酶。研究数据表明提高dicer表达量，能够增强干扰效率：

如图，通过双荧光素酶实验，将dicer表达质粒载体或对照载体和shRNA共同转入hela细胞中，检测荧光素酶活性，结果表明提高dicer表达量，荧光素酶活性显著下降，即干扰效率增强。

shRNA序列设计

案例1

shRNA序列长度影响干扰效率：

如图，设计不同长度的EGFP shRNA，在HEK293细胞中检测到，碱基序列为19-21bp时的干扰效率较18bp和22bp时更好。

案例2

loop环大小为6nt或9nt时，并且shRNA结构为正义链-loop环-反义链时的干扰效率最好。

如图，研究数据表明，loop环大小为6nt或9nt时较4nt的干扰效率明显好，并且shRNA结构为sense-loop-antisense时，干扰效果更好。

干扰效率低怎么办？总结提升效率4个关键

干扰效率低怎么办？总结提升效率4个关键

案例3

loop环碱基序列影响基因干扰效率：

如图，研究表明将目的基因序列克隆在荧光素酶报告基因载体的3’UTR端，分别与不同的shRNA载体共同转染HEK293细胞中，通过分析荧光素酶活性发现，5-nt loop环上额外的2个碱基对RNAi干扰效率不可或缺。

干扰效率低怎么办？总结提升效率4个关键

干扰效率低怎么办？总结提升效率4个关键

总结-（提高干扰效率的方法）

06

1. 避免用淋巴细胞做干扰实验；

2.提高RNAi/mRNA表达水平比例，提高干扰效率，主要途径是提高siRNA或shRNA表达水平；

3.提高ago2或dicer基因表达水平，提高干扰效率；

4. 设计shRNA碱基序列为19-21bp。

参考文献：

[1]Deming Gou.A new design of a lentiviral shRNA vector with inducible co‑expression of ARGONAUTE 2 for enhancing gene silencing efficiency[J].Cell & Bioscience,2015

[2]Klaus Rajewsky.Efficiency of RNA Interference in the Mouse Hematopoietic System Varies between Cell Types and Developmental Stages[J].MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,2005[3]Ben Berkhout.Optimization of shRNA inhibitors by variation of the terminal loop sequence[J].Antiviral Research,2010[4]Kazunari Taira.Overexpression of Dicer enhances RNAi-mediated gene silencing by short-hairpin RNAs (shRNAs) in human cells[J].Nucleic Acids Symposium Series,2004[5]KEVIN G. RICE.Potency of siRNA Versus shRNA Mediated Knockdown In Vivo[J].Wiley InterScience,2007[6]Tuva Barøy.shRNA Expression Constructs Designed Directly from siRNA Oligonucleotide Sequences[J].Mol Biotechnol,2010[7]Ashok A. Deniz.siRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites[J].PNAS,2006[8]John Nemunaitis.siRNA vs. shRNA: Similarities and differences[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2009

本文转自汉恒生物返回搜狐，查看更多