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翻译 by 熊沐钊，王康，杨萍，蔡琳果

卷首语

自17世纪第一台符合科研工作需求的显微镜问世，人类对于微观世界的追求从未停歇。尽管电子显微镜的高分辨率已将人类视野带入细胞乃至分子的微观世界，但高通量测序技术的迭代更新又再次将系统生物学研究推向了一个新纪元。随着对生命活动认识的不断加深，个体、组织乃至细胞复杂的异质性推动着人类更进一步地向单细胞层面进行探究——单细胞转录组测序技术应运而生。

如前文所述，繁复的生命活动从个体、组织到细胞都存在着巨大的异质性。衰老作为每个个体生命历程的必经之路，它在不同组织、不同细胞中的体现也大不相同。衰老生物学领域的研究人员经过长期探索，得以获得众多解析个体、组织器官以及细胞衰老的前沿成果。2022年5月，Trends in Cell Biology杂志发表了题为“The heterogeneity of cellular senescence: insights at the single-cell level”的综述文章，从衰老标志物、动物模型以及多器官衰老异质性等方面，对高分辨率测序技术在衰老异质性研究领域的前沿进展进行了总结与展望。

摘 要

细胞衰老与个体的衰老和疾病的发生发展联系紧密，并可作为延缓衰老进程的靶标。检测体内衰老细胞的一个常用标记物是p16，目前基于这一标记物的研究已经在衰老及相关领域获得了众多进展。最近也有研究报道了除p16以外的新的衰老标记物，并强调了研究细胞和组织中衰老异质性的重要性。随着诸如单细胞RNA测序和单核RNA测序等高通量技术的发展，我们可以在单细胞水平上对衰老细胞进行研究，并可能发现新的衰老标记物。本综述强调了衰老异质性研究的重要性，并针对如何高效利用先进技术和测序数据集进行了讨论。

正 文

了解细胞衰老异质性的重要性

衰老是引发常见衰老相关慢性疾病的最大危险因素。老年科学理论（Geroscience hypothesis）指出，旨在延缓生物衰老的策略将通过减少多种慢性疾病的发生和发展来改善老年人的健康状况。细胞衰老已成为一种可以延迟衰老进程的关键靶点。特异性消除衰老细胞的“senolytic”药物的发现引起了人们对衰老干预研究的兴趣，并进一步推动了相关的动物研究以及随后的临床前和临床试验。

细胞衰老是指在暴露于多种应激后，细胞周期的持续停滞。衰老细胞与细胞周期调节因子的高表达有关，如参与调节细胞周期阻滞的Cdkn2a（p16）和Cdkn1a（p21）。目前衰老研究领域中已涌现出很多基于多种p16小鼠模型的研究成果。然而，p16可能不是细胞衰老的特异或敏感标记，因为并非所有p16高表达（p16high）细胞都一定是衰老的，一些衰老细胞也并不会表达p16。目前，已有研究开始揭示不同组织中细胞衰老的显著异质性，并突出了p16以外的细胞衰老标记物的重要性，包括Cdkn1a（p21），Cdkn2d（p19）、uPAR和糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（Glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，GPNMB）。这些研究更进一步的强调了深入解析衰老细胞异质性的重要性。

本综述总结了衰老生物学的最新进展，重点描述了衰老细胞的异质性，并针对使用高通量数据集检测衰老进行了讨论。文章首先讨论有关衰老细胞的生物学知识，然后回顾用于研究衰老细胞异质性的新技术和分析方法，同时对在不同组织单细胞水平上的几项关注衰老细胞转录组的研究进行了总结。本综述对未来的几个发展方向进行了展望，包括新模型的建立和精准医学策略在衰老细胞中的应用。同时，本综述还提供了除基于p16模型之外的其他相关研究进展。

当前对衰老细胞生物学的共识

在20世纪60年代，细胞衰老这一概念起源于人们的一项发现——人类成纤维细胞不能无限期分裂并最终进入不可逆的细胞周期停滞状态。细胞衰老这一概念便由此起源。自2011年以来，针对衰老细胞的体内研究快速发展，其中一项开创性的研究表明，清除p16high细胞可以改善早衰小鼠的组织功能。细胞可以通过多种触发因素走向衰老，如致癌应激、端粒磨损、基因毒性药物和氧化应激等。虽然衰老细胞的标记物还没有完全、精准地得以诠释，但人们已经对某些关键的衰老细胞特征达成了共识（图1）。目前研究发现，在衰老、疾病或进行某些特定生命活动（如伤口愈合和胚胎发育）的组织中存在衰老细胞的积聚，而这一现象在年轻和健康的组织中则很少见。此外，有证据表明，衰老细胞也可能存在于有增殖活动的组织中，但在不同的条件下这些衰老细胞也存在不同频率的动态变化，这一发现进一步加深了我们对衰老细胞分布的理解。此外，衰老细胞产生一种典型的促炎分泌物，统称为衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype，SASP）。此外，衰老相关β半乳糖苷酶（Senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-gal）活性增加、脂褐素在溶酶体中的蓄积、细胞质DNA增多、抗凋亡通路激活（通过衰老细胞抗凋亡通路；Senescent cell anti-apoptotic pathways，SCAPs），以及一些细胞核中的变化，包括Lamin B1的丢失、端粒缩短、衰老相关异染色质聚集和端粒DNA损伤（Telomere-associated foci，TAF）。在转录水平上，p16和p21是衰老细胞最常用的两种标记物。这些特征已被广泛用于识别个体衰老或其他病理条件下多种组织中的衰老细胞。然而，这些特征可能并非在所有衰老细胞中都是保守的，并且可能不足以或无法在体内检测衰老异质性。

图1 衰老细胞生物学当前研究进展总结

衰老细胞随着衰老、疾病以及多种生命活动过程在组织中积累，并处于增殖停滞状态，同时利用衰老细胞抗凋亡通路维持其调控网络。衰老细胞分泌的SASP会损伤周围组织，并增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21的表达，降低Lamin B1的表达。衰老细胞还表现出颗粒度增加、胞质DNA产生、SA-β-gal染色阳性率增加、端粒缩短、TAF和衰老相关异染色质灶的产生。

衰老异质性

衰老细胞对其清除药物（senolytics）表现出不同程度的敏感性，意味着衰老细胞的异质性被首次揭示。显然，目前所有的抗衰老药物对不同的衰老细胞群都有不同的功效。例如，达沙替尼在消除衰老的前体脂肪细胞方面最为有效，而槲皮素能更好地靶向内皮细胞。漆黄素（Fisetin）和Navitoclax均能杀死衰老的成纤维细胞和内皮细胞，但对衰老的前体脂肪细胞的作用有限。此外，我们对于单细胞水平上的哪些细胞群受影响仍然缺乏了解，这限制了清除衰老细胞药物在更广泛的病理背景下的应用。考虑到这样的问题存在于各种不同的慢性疾病，并且正在进行的临床试验数量也在不断增加，所以，这些信息的确定至关重要。

对来自人类（包皮成纤维细胞、表皮黑素细胞）和小鼠（胚胎成纤维细胞、皮肤微血管内皮细胞）成纤维细胞的转录组测序（RNA-seq）数据的分析显示，基于不同衰老诱导剂、细胞类型和衰老阶段的转录组特征和SASPs存在差异，这可能导致功能的差异。此外，在同样培养条件培养的人类成纤维细胞中，衰老细胞间也具有转录组多样性。单细胞分离和纳米流体PCR实验表明几个衰老相关基因之间的基因表达缺乏相关性。基于这些体外研究结果，体内的衰老细胞也可能是异质性的，这种异质性可能来自于年龄、性别、病理状态、组织位置、微环境以及其积累的动力学的多样性。目前的研究并没有很好地描述这些差异，未来需要更多使用高分辨率方法的研究，如单细胞RNA-seq、单核RNA-seq或其他单细胞分辨率技术来揭示体内不同条件下衰老细胞的特征。

用于理解体内衰老细胞异质性的模型

一直以来，p16在体内研究衰老的标记物中占据主导地位，并帮助确定了p16高表达细胞在各种年龄相关条件下的因果作用。然而，最新证据表明，p16用于标记衰老可能既不敏感、也不具有特异性，因为一些p16高表达细胞并不衰老（例如，胰腺β细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、内皮细胞），且不是所有的衰老细胞都表达高水平的p16。此外，由于不同的转基因设计（如不同的p16启动子或转基因位置），多个p16小鼠模型可能在体内不是靶向相同的p16高表达细胞。虽然senolytics被广泛用于评估衰老细胞在体内的作用，但不同的senolytics所靶向的具体细胞群很大程度上仍是未知的。这些技术难题使我们对细胞衰老的理解局限于体内一部分的衰老细胞。

许多新的研究已经在体内检测了衰老细胞中除p16以外的其他表达标记物。2021年，有研究建立了p21-Cre转基因小鼠模型，其中包含一个驱动Cre诱导的p21启动子。该模型在体内以p21高表达细胞为靶点，这些细胞占老年小鼠各种组织中细胞的1%-10%，与p16高表达细胞不同，两者均表现出衰老的一些关键特征。值得注意的是，清除p21高表达细胞有效减轻了衰老标志物的信号，改善了老年小鼠的机体功能，并缓解了肥胖小鼠的代谢功能障碍。在另一项研究中，通过比较三种已知衰老小鼠模型的批量RNA-seq数据集中的差异表达基因，尿激酶纤溶酶原激活物受体（urokinase plasminogen activator receptor，uPAR）被鉴定为一种独特的衰老标记物，这一发现也通过流式细胞术进行了验证。用嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞消除表达uPAR的细胞，在体内和体外都能特异性地杀死衰老细胞，并延长肺腺癌小鼠的寿命。此外，另一项针对血管内皮细胞的转录组研究鉴定出细胞表面蛋白GPNMB作为衰老细胞的标记物，与人类动脉粥样硬化患者和小鼠中的非衰老细胞相比，其在衰老血管内皮细胞中明显富集。通过遗传操作消除GPNMB阳性细胞有效减少了肥胖小鼠的衰老细胞负担，并改善了代谢异常。GPNMB疫苗接种也改善了一些与老化相关的疾病。这些令人兴奋的发现才刚刚开始阐明各种衰老细胞群在体内的作用。此外，正如先前发现的不同衰老标记物所证明的那样，一个标记物可能不足以实现衰老细胞鉴定，而许多标记物和特征的结合将确保细胞的衰老状态。综上所述，新的衰老标记物的发现以及新的小鼠模型的产生对于研究衰老的异质性以及设计新的senolytics疗法具有重要意义。

目前在单细胞水平上检测衰老细胞的高通量技术

目前关于衰老异质性的知识差距强调了需要改进技术来更准确地识别和表征衰老细胞。随着技术的进步，单细胞/细胞核RNA-seq方法是研究衰老异质性的有效工具之一（表1）。这些方法在分子水平上观察单个细胞和定义转录组特征方面具有一定的优势。虽然单细胞RNA-seq仍然是捕获单个细胞转录组的最全面的方法，但由于其高测序深度，它可能会错过捕获体积大或对解离过程敏感的细胞，其中可能包括一些衰老细胞，因为它们往往体积较大并且较脆弱。相反，单核RNA-seq可能捕获所有类型的细胞，而由于细胞核中mRNA的丰度较低，测序敏感性可能较低。空间转录组学是另一种新开发的方法，它允许通过RNA-seq对小组织切片进行转录组检测，同时保持这些切片的组织学信息。随着未来单细胞水平分辨率的改进（当前分辨率~55 μm，同一位置可鉴定1到10个细胞），空间转录组技术可能具有重要作用，因为它将捕获所有衰老细胞类型并提供关键的空间位置信息，这是单细胞/核RNA-seq无法实现的。这些基于RNA测序的有力方法可以同时检测数千个转录本，这对于发现新的衰老细胞标记物至关重要。然而，目前方法的测序深度仍然相对较低，在每个细胞中只有50%-60%的转录本可以被测序检测到。这可能是定位衰老细胞的一个特别挑战，因为它们在体内的丰度很低。通过流式细胞术或其他技术对衰老细胞进行细胞分选富集可能有利于提高测序灵敏度，但需要有效、特异的衰老标记物。

表1 衰老异质性检测技术概述

除了这些高通量方法外，高灵敏度的检测方法也同样有价值。例如，基于多种抗体的成像（multiplexed antibody-based imaging，mABI）技术，如成像型质谱流式系统（imaging mass cytometry，IMC）和单细胞蛋白组学（codetection by indexing，CODEX）同时使用可以检测20-50个特定基因在每个细胞的蛋白质水平，这是对基于转录水平检测的一个有用的补充——特别是考虑到与衰老细胞相关的转录组和蛋白质组数据集的潜在相关性较差这一现象。多重荧光原位杂交（Multiplex fluorescence in situ hybridization，mFISH）是另一种检测衰老细胞的有效方法，它可以在单分子分辨率下检测到100多个特定基因。这些高分辨率的方法对于验证单细胞/细胞核RNA测序识别的靶点以及评估衰老细胞周围的微环境非常重要。

另一种检测衰老细胞的有用技术是流式细胞术成像，它已被用于检测体内衰老细胞。该方法的主要优点在于，它可以在蛋白质水平上检测几种衰老标记物或报告基因，并以相对高通量的方式在单细胞水平上评估几种衰老特征。这些特征包括SA-β-gal染色、细胞大小、增殖能力、DNA损伤灶和胞质DNA的存在，所有这些特征目前都不能通过基于测序的方法来测量。一种尚未用于研究衰老的方法是单细胞质谱，包括单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学，它们提供蛋白质（包括翻译后修饰）和大规模代谢物鉴定，可能对衰老细胞的研究具有重要影响。

高通量RNA-seq方法对于更深入地了解衰老细胞很重要，但分析方法也同样重要。在本篇综述中，作者举例并讨论了几种不同的方法（方框1）。它们是从大型数据集中分析衰老细胞的抽样方法。这些方法连同其他新兴技术，有助于我们对衰老细胞有更加统一的理解。

框1 研究衰老细胞的分析方法示例

一项研究分析了GTEx项目中50种人体组织的转录组数据，包括组织和单细胞RNA测序数据集。虽然已有先前研究对该数据集进行了计算分析，但该研究通过生成衰老基因共表达模块和网络进一步分析了衰老组织，并整合了组织和单细胞RNA测序数据集。该研究能够识别50多个在多种人体组织中保守的衰老基因。这一宝贵数据集可应用于单细胞和其他高分辨率数据集，并有助于定义多种组织的细胞特征。

另一种有用的方法是特征基因法，具体方法为提取不同组织类型中与衰老有关的基因，并将该基因的平均表达量与同一基因序列中的其他所有基因进行加权。操作者通过主成分分析（PCA）优化权重，并计算所有细胞中每个特征基因的平均表达。如果特征基因表达水平大于其他所有细胞的平均表达水平加上三倍标准偏差的和，则将其定义为衰老细胞。总之，这种方法允许使用无偏差的方法检测衰老细胞，并且可能有助于识别新的标记物。

有课题组通过使用公开可用的单细胞和批量RNA序列数据集，创建了一个更全面的衰老标记列表（SenMayo），其中包括125个基因，主要是SASP因子。研究发现，这些基因与年龄、p16和p21水平以及小鼠和人体组织中衰老细胞的负担高度相关，这些基因可能是鉴定衰老细胞的宝贵资源。

组织衰老异质性（单细胞/单细胞核水平）

目前学术界对衰老异质性的认识还不够。为了填补这一空白，作者回顾了几项在单细胞水平上检测衰老细胞的高分辨率研究，并指出需要利用这些强大的数据集来寻找p16和p21以外的标记物。

脂肪组织

一项研究利用单细胞RNA-seq和其他技术检测肥胖小鼠脂肪组织中的p21high和p16high细胞。研究者们发现p21high和p16high细胞在细胞类型、组织位置、积累动力学和生理作用方面是两个不同的细胞群体。在老年小鼠的实验中也出现了同样的结果。值得注意的是，在衰老和肥胖的背景下，脂肪中p21high细胞表现出许多关键的衰老特征（通过成像流式细胞术评估）。此外，另一项研究针对从年轻和老年小鼠分离的脂肪间充质干细胞进行单细胞RNA-seq，结果显示p21high细胞随着年龄的增长而积累更多的细胞数量，并表达出许多在体外诱导的衰老细胞中常见的可改变通路，包括上调SCAPs、SASP、NF-κB、HMGB1和FOXO通路。虽然这些研究显示了一个新的衰老细胞群体，但是我们要认识到p21与p16一样可能不是衰老细胞的特异性标记。

大脑

单核RNA-seq和单细胞RNA-seq表明，老年小鼠中p16high和p21high细胞在老年小鼠海马的小胶质细胞、少突胶质祖细胞（OPCs）和少突胶质细胞中积累更多，并具有一定程度的异质性。一项使用特征基因方法进行的单核RNA-seq研究发现，人脑中p19/CDKN2D是阿尔茨海默病患者死后大脑中衰老细胞的最重要标志物，并且该项研究定义了一组阿尔茨海默病患者的大脑中独特的衰老细胞。mFISH和mABI进一步验证了阿尔茨海默病患者大脑中p19的上调，其他实验证实表达p19的细胞具有几个关键特征，包括比不表达p19的细胞具有更大的细胞核和更多的脂褐素阳性细胞。该数据集发现的衰老细胞主要是兴奋性神经元，并伴随阿尔兹海默症常见的tau样病理特征。这项高分辨率研究也揭示了它的一些局限性。例如，一些SASP基因被用来识别衰老细胞，但它们的表达水平在没有共同衰老特征的细胞中也发生上调。这进一步强调需要开发一种更全面和准确的方式来定义衰老细胞。

肝脏和肾脏

最近的一项研究使用p16-Cre小鼠模型通过单细胞RNA-seq来检测肝脏和肾脏中的p16high细胞。在健康和年轻的小鼠肝脏中，p16high细胞主要是内皮细胞和少量Kupffer细胞。在患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的小鼠肝脏中，p16high细胞主要是巨噬细胞以及其他细胞类型。在健康和年轻的肾脏中，p16high细胞主要是上皮细胞。p16high细胞的基因功能富集（GO）分析显示，在不同的细胞类型和条件下，p16high细胞存在高度异质性的通路变化。尽管这个发现令人兴奋，但仍不清楚这些p16high细胞是否存在其他衰老特征。

眼睛

另一项研究利用基因集变异分析（GSVA）方法分析患有增殖性视网膜病变小鼠视网膜的单细胞RNA-seq数据集，发现某些类型的细胞，包括星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞和胶质细胞，表达衰老相关基因集中的基因。上述研究确定了视网膜中高度表达Col1a1的衰老内皮细胞亚群，该细胞可被一种干预衰老药物特异性消除。这项研究利用已知的衰老基因集来识别衰老细胞，包括一个衰老反应亚群，并确定除p16和p21之外的一个新的衰老标记物。

其他组织

Tabula Muris Senis或小鼠衰老细胞图谱，是一个于2020年完成的单细胞RNA-seq数据库，其中包含小鼠整个生命周期内的23个组织的测序数据。这一大型数据库的一个组成部分是对老年小鼠群体的衰老进行检查，分析结果表明这一大型数据库的组成部分之一是老年小鼠群体衰老的检查结果，结果表明p16的表达随着年龄的增长而显著增加，E2f2、Lmnb1、Tnf和Itgaf也是如此。值得注意的是，E2f2和Lmnb1在衰老细胞中的表达通常下调。这个数据库提供了一个全面的大规模研究以促使我们了解衰老细胞。随着单细胞RNA-seq敏感性的快速提高，该数据库可得以改进以促使我们更好地了解体内衰老的异质性。

另一项研究使用单细胞RNA-seq来比较老年小鼠和年轻小鼠之间肾脏、肺脏和脾脏的转录组差异。研究者发现随着年龄的增长，不同类型的细胞表达独特的基因，相似类型的细胞在基因富集方面表现出相似的衰老轨迹，而不同类型的细胞具有不同的轨迹。该研究显示了三种组织中随年龄差异表达的常见基因，包括SRP依赖性蛋白翻译中的基因表达减少和炎症相关基因表达上调。

总之，在大多数相关研究中，衰老细胞分布在不同的细胞群中，而不是形成特定的簇，这一结果进一步证明了异质性的存在。已知的衰老标记物（p16或p21）可以用于衰老细胞的鉴定。鉴于这些标记的局限性，我们有必要评估其他衰老特征，以便更好地了解这些细胞群。此外，这些强大的数据集可以用来发现新的衰老标志物，并通过更好的计算分析来研究衰老生物学。

结束语

就像本文所讨论的这样，衰老生物学具有多层次复杂性，因此我们迫切需要研究细胞衰老的异质性，为衰老细胞寻找新的和更特异的标记物，并开发模型和技术，以改进其在健康和疾病组织中的检测。此外，本综述中描述的衰老细胞的组织特异性差异表明，多个标记物的组合相对于一个标记物，可以更准确地检测衰老细胞。单细胞/细胞核RNA-seq以及其他高通量测序方法加深了对衰老细胞异质性的理解。但这仅是浅尝即止，研究者们迫切需要进行更详细和全面的研究来解决下文提到的悬而未决的问题。

鉴于上述所有研究的挑战和复杂性，美国国立卫生研究院（NIH）共同基金会成立了细胞衰老网络（SenNet）计划，旨在系统地识别和表征衰老细胞中的异质性，这些细胞涉及生命周期中多种健康的人体和小鼠组织。SenNet旨在提供可公开获取的衰老细胞图谱，突出它们之间的差异，并识别不同组织中的分泌因子。它还旨在开发创新工具和技术，更好地探测和检测这些稀有细胞。通过实现这些目标，SenNet有望显著推进衰老研究。

由于靶向衰老细胞具有很高的治疗价值，了解衰老的异质性也将在开发改善老年人群的精确医学方法方面发挥重要作用。例如，研究发现保守和敏感的衰老标记物可以提高衰老细胞的检测灵敏度，也可以评估抗衰老功效；了解衰老细胞的动态特性将有助于确定更好的干预衰老治疗时机；有关组织特异性衰老细胞的信息可以开发新的干预衰老传递途径来提高药物效力；了解疾病特异性衰老细胞可以提高治疗效果，减少副作用；关于个体特异性衰老细胞的数据可以指导选择更有效的干预衰老药物，从而改善药物反应性和临床结果。

总之，更好地理解衰老异质性可以为设计干预措施提供有用信息，可以更准确地针对患病和衰老组织，这可能会彻底改变老年群体的患者护理系统。

悬而未决的问题

(1)衰老细胞在所有组织中都有普遍的特征吗？衰老细胞特征是否存在组织特异性或疾病特异性？

(2)与有益细胞相比，致病性衰老细胞群是否具有独特特征？

(3)基于异质性设计不同的干预衰老药物以更精确地治疗疾病是否可行？

(4)衰老的细胞特征会随着时间而改变吗？

(5)一个组织的细胞衰老负荷与同一个体内其他组织的细胞衰老负荷相关吗？

(6)Senolytics具体靶向哪类衰老细胞群？

(7)Senolytics对非衰老细胞的副作用是什么？

(8)当细胞被衰老药物靶向治疗时，周围组织区域发生了什么变化？

(9)各种转基因小鼠模型靶向的p16high和p21high细胞是什么？

(10)分析衰老细胞数据的最佳方法是什么？

原标题：《【重磅综述】单细胞水平解析衰老异质性》

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