表位(Epitopes)是抗原分子中决定特异性免疫应答的关键化学基团，是诱导免疫反应的结构基础，T、B细胞优势多表位的联合可显著诱导机体全面的免疫反应。但由于表位免疫原性弱的问题需要选择合适的表位运载与释放体系，构建合适的表位与载体的融合体，一方面提高优势表位的免疫原性[1]，另一方面，达到表位与载体协同免疫的理想效果。

刚地弓形虫Toxoplasma gondii感染后的最大危害是通过垂直传播导致不良妊娠[2-4]，而人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)高危型别16和18型感染与宫颈癌的发生发展相关，预防弓形虫和HPV的感染均是针对育龄期妇女，二者有着相同的免疫人群，可实现协同免疫效果。除此之外，各型别的HPV晚期结构蛋白L1、L2在体内外均可自行组装成病毒样颗粒形式，可有效提呈抗原表位，作为抗原释放载体优势显著[5-7]。

本研究前期工作利用生物信息学方法，对弓形虫感染的两个关键抗原分子——主要膜表面蛋白1 (SAG1)和棒状体蛋白2 (ROP2)的优势表位进行了预测和筛选，构建了ROP2和SAG1多表位的优势组合(即RSepitope)，同时对潜在的表位运载与释放系统进行了筛选，例如，选择乙肝病毒核心抗原(HBcAg)中的主要免疫显性区域(Major immunodominant region，MIR)为表位载体，体外可实现表位与载体融合的有效表达，体内可诱导表位特异性免疫反应[1]。

为了进一步优化融合体的免疫效应，实现协同免疫反应，本研究选择HPV16型L1为载体，构建弓形虫多表位RSepitope与HPV16L1的融合体[8]，分析RSepitope和HPV16L1不同融合体形式的体外表达特征和体内免疫学效应，为RSepitope和其载体的优化组合及其免疫方案提供合理的设计策略。

弓形虫优势多表位(RSepitope)与载体HPV16L1的融合体质粒pcDNA3.1/RSepitope- HPV16L1 (RSepitope融合于HPV16L1的N端)、pcDNA3.1/HPV16L1-RSepitope (RSepitope融合于HPV16L1的C端)由本室构建和保存，详细描述见已发表论文[8]；COS-7细胞购自中国科学院上海细胞库(GNO 2)；6–8周雌性BALB/c小鼠(基因型为H2-Kd，编号No. SCXK (Shanghai))饲养于温州医科大学实验动物中心(SPF级)，实验动物操作按照实验动物伦理要求规范执行。

核酸分子质量标准DNA Marker、蛋白分子质量标准预染Marker，2×PCR Master Mix均购自Thermo公司；无内毒素质粒抽提纯化试剂盒(Endofree Plasmid Maxi Kit)购自美国Omega公司；转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒(ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)为Thermo产品；HPV16L1单抗购自赛默飞试剂公司(美国)；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgG1、HRP-羊抗鼠IgG2a、FITC标记羊抗鼠IgG以及PI荧光染料均购自联科生物技术有限公司(KPL公司产品)；IFN-γ ELISPOT试剂盒为Dakewe Quick SpotTM系列产品。其余试剂均为国产分析纯。弓形虫ROP2-SAG1优势多表位(RSepitope)蛋白的制备见参考文献[9]，RSepitope免疫兔血清由本室制备并保存，RSepitope多表位序列中一条T细胞表位肽(同时包含CTL (杀伤性T淋巴细胞)和Th (辅助性T淋巴细胞)表位肽)由上海波泰生物科技有限公司合成(纯度95%以上)。

优势表位RSepitope基因序列通过真核密码子优化(Java Codon Adaptation Tool，http://www.jcat.de/)，与HPV16L1融合后的重组真核表达质粒pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1、pcDNA3.1/ HPV16L1-RSepitope、pcDNA3.1/RSepitope以及质粒对照pcDNA3.1转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株进行扩增，用去内毒素质粒DNA抽提试剂盒提取和纯化质粒，具体操作按照说明书进行。获得质粒通过PCR和DNA测序鉴定。

重组真核表达质粒与脂质体以2︰1的比例电转染COS-7细胞，具体操作按LipofectamineTM 2000转染试剂说明书进行，转染细胞培养48 h后，收集细胞，分别通过RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blotting)以及免疫荧光实验(Immunofluorescence)鉴定目标基因和目标蛋白的表达。①RT-PCR：分别以RSepitope和HPV16L1的引物扩增相应的目标基因；②Western blotting：分别用RSepitope免疫血清、HPV16L1单克隆抗体印迹目标蛋白；③Immunofluorescence：分别以RSepitope免疫血清、HPV16L1单克隆抗体结合目标蛋白，再以荧光标记抗体显示荧光。

采用前期研究[10]确定的“初免-加强免疫”的方案(即：2次DNA免疫再加强1次蛋白免疫)。6–8周龄BALB/c雌性小鼠(基因型为H2-Kd)随机分成6组(5只/组)，按表 1所列方案免疫实验动物。

Group 1为单独RSepitope表位免疫组；Group 2为RSepitope融合在HPV16L1“N”端融合体免疫组；Group 3为RSepitope融合在HPV16L1“C”端融合体免疫组；Group 4为RSepitope表位蛋白免疫对照组；Group 5为质粒载体免疫对照组；Group 6为等体积的PBS免疫对照组。免疫共进行3次，间隔2周，DNA免疫采用肌肉注射，剂量为每次100 μg/鼠；蛋白免疫采用皮下注射，剂量为每次5 μg/鼠，蛋白与等量弗氏完全佐剂(CFA)混合后行第1次免疫，与等量不完全弗氏佐剂(IFA)混合后行第2、3次免疫。免疫开始的第0、2、4、6周分别尾静脉取血分离血清，测定RSepitope特异性抗体总IgG以及抗体亚类IgG1和IgG2a。最后1次免疫结束1周后处死小鼠分离脾脏，制备单个脾细胞悬液，ELISPOT试剂盒测定IFN-γ的生成量。

免疫鼠血清中RSepitope特异性抗体水平采用ELISA方法测定。将10 μg/mL的RSeiptope表位蛋白(100 μL)加入到96孔酶标反应板中4 ℃孵育过夜，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后，加入100 μL/孔1︰100稀释的各组免疫血清于37 ℃孵育2 h，洗涤后分别加入100 μL/孔1︰3 000稀释的HRP-标记的羊抗鼠IgG、羊抗鼠IgG1以及羊抗鼠IgG2a于37 ℃孵育2 h。洗涤后，加入底物邻苯二胺(OPD，Sigma)和过氧化氢(H2O2)，于37 ℃避光显色10 min后，于酶标仪(Bio-Tek ELx800，USA) 492 nm处测定光吸收度。每个样品均设置3个复孔。

第6周免疫血清进行2倍的系列倍比稀释检测RSepitope特异性抗体IgG效价，操作过程如上所述，每个样本同样设置3个复孔。

收集免疫第6周的小鼠脾脏制备单细胞悬液，于细胞裂解液(0.83% NH4Cl，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.2)中作用1 min裂解红细胞。PBS洗涤后，将细胞数目调整至5×106/mL后，100 μL/孔细胞悬液加入到包被有抗IFN-γ单克隆抗体的酶标反应板中，再加入25 μg/mL RSepitope多表位中的一条T细胞表位肽(CTL+Th表位，序列为TEWIFKRC RNIELSEPVKFL)共孵育20 h，后续的操作按照ELISPOT检测试剂盒说明书进行。显色后斑点数目通过酶联斑点成像自动分析仪(Elisporeader 400 PRO-X，BiosysBioreader®，Germany)测定。每个样本均设3个复孔。

所有变量均以平均值±标准差(x±s)表示，应用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析(AVOVA)，各实验组与对照组比较采用t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

RSepitope通过真核密码子优化后的基因序列见表 2，优化后的RSepitope基因序列GC含量从64.02%提高到71.21%。

优化的RSepitope重组真核表达质粒pcDNA3.1/ RSepitope、pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1、以及pcDNA3.1/HPV16L1-RSepitope抽提和纯化后，PCR扩增RSepitope基因，均可得到一个282 bp的目的片段(图 1，泳道4、5、6)；而PCR扩增HPV16L1基因，质粒pcDNA3.1/RSepitope- HPV16L1和pcDNA3.1/HPV16L1-RSepitope可扩增出一个1 500 bp的目的基因片段(图 1，泳道7和8)。序列分析显示RSepitope和HPV16L1融合体构建成功(测序结果略)。

重组质粒转染COS-7细胞后，逆转录PCR (RT-PCR)、蛋白免疫印迹、免疫荧光检测目的基因mRNA、目的蛋白。RT-PCR结果显示：转染pcDNA3.1/RSepitope-HPV16L1质粒的细胞检测到RSepitope基因片段(282 bp，图 2泳道1)和HPV16L1基因片段(1 500 bp，图 2泳道6)；而转染pcDNA3.1/HPV16L1-RSepitope质粒的细胞检测不到RSepitope和HPV16L1基因片段(图 2泳道3和8)；转染pcDNA3.1/RSepitope质粒的细胞仅能检测到RSepitope基因片段(图 2泳道2)，检测不到HPV16L1基因片段(图 2泳道7)。

Western blotting结果显示：转染pcDNA3.1/ RSepitope-HPV16L1重组质粒的细胞裂解液，均可免疫印迹到RSepitope (10 kDa)和HPV16L1 (65 kDa)目标蛋白；转染pcDNA3.1/HPV16L1- RSepitope重组质粒的细胞裂解液，均无RSepitope和HPV16L1目标蛋白的表达；pcDNA3.1/RSepitope转染细胞裂解液可检测到目标蛋白RSepitope，结果见图 3。

免疫荧光实验结果显示：转染pcDNA3.1/ RSepitope-HPV16L1重组质粒的COS-7细胞均可检测到RSepitope和HPV16L1的共表达(分别显示绿色荧光)；转染pcDNA3.1/RSepitope的细胞仅能检测到RSepitope的表达(绿色荧光)；转染pcDNA3.1/HPV16L1-RSepitope重组质粒的细胞，均无RSepitope和HPV16L1的表达，均未显示绿色荧光，结果见图 4。

图 2–4实验结果表明：RSepitope融合在HPV16L1“N”端的融合体(RSepitope-HPV16L1)在细胞内可以正常转录，可实现表位与载体蛋白的共表达；RSepitope融合在HPV16L1“C”端的融合体(HPV16L1-RSepitope)在细胞内不能正常转录和翻译。

免疫血清中RSepitope特异性抗体生成水平呈时间依赖关系，于免疫第6周抗体产生达到峰值，尤以Group 2 (RSepitope-HPV16L1融合体DNA初免蛋白加强免疫组)和Group 4 (RSepitope蛋白免疫对照组)抗体量最高，分别为2.706±0.193和2.547±0.069，虽两组间差异不具有显著统计学意义(P > 0.05)，但分别比较其他各组，差异均具有显著统计学意义(P < 0.05)。Group 3 (HPV16L1-RSepitope融合体DNA初免蛋白加强免疫组)体内没有显示出免疫原性，其低水平抗体应该是最后一次RSepitope蛋白加强免疫所致。特别于第4周和第6周，Group 2抗体IgG产生量显著高于Group 1 (RSepitope非融合体DNA初免蛋白加强免疫组)，差异具有显著统计学意义(P < 0.05)，提示HPV16L1作为表位载体的优势效应，不仅可提高表位的免疫原性，pcDNA/RSepitope-HPV16L1表达水平是否高于pcDNA/RSepitope待后续研究分析，见图 5A。

Group 2和Group 4 (均为抗体生成水平较高组)免疫血清，于第6周确定抗体效价，结果显示：血清稀释至1︰10 240时，两组能够检测到的抗体水平分别为0.788±0.147和0.575±0.174；稀释至1︰20 480时，Group 2检测到的抗体低至0.370±0.039，因此确定该组抗体效价为1︰10 240 (图 5B)。实验结果证实：RSepitope-HPV16L1融合体两次DNA免疫再以蛋白加强免疫的方案即可达到单独蛋白免疫所产生的抗体水平。

各组免疫血清检测抗体亚类IgG1和IgG2a确定免疫反应类型，结果显示：Group 1 (非融合体)和Group 2 (融合体)的RSepitope特异性抗体亚类IgG1和IgG2a产生水平，差异均无显著统计学意义(P > 0.05)，说明“两次DNA免疫再以蛋白加强免疫”的方案既可诱导Th1型又可以诱导Th2型免疫反应类型(即：同时诱导体液和细胞免疫反应)，而Group 2抗体亚类产生水平明显高于Group 1，显示了融合体中HPV16L1的载体优势效应。Group 3和Group 4的IgG1产生水平显著高于IgG2a，差异均具有显著统计学意义(P < 0.05)，提示蛋白质免疫诱导偏向Th2免疫反应类型(主要是体液免疫)，Group 3产生的较低水平IgG1和IgG2a推测应该归因于最后一次RSepitope蛋白加强免疫所致，见图 6。

RSepitope表位中的一个T细胞表位肽与免疫鼠脾细胞共孵育后检测IFN-γ产生水平，结果见图 7A–B。Group 2的3只小鼠脾细胞均可检测到最多数量的IFN-γ斑点数，分别比较其他组别，差异均具有显著统计学意义(P < 0.05)，该组显著的细胞免疫可能不仅源于免疫方案，而且可能也得益于HPV16L1的载体优势效应，提高了表位的表达水平。pcDNA3.1 (质粒对照组)比较PBS对照组也有一定的IFN-γ产生，差异具有显著统计学意义(P < 0.05)，提示可能存在非特异性免疫刺激效应。

表位免疫可提高免疫反应的特异性，T、B细胞多表位的联合可全面诱导有效的体液和细胞免疫反应。优良的表位运载体系可显著提高表位免疫原性，如HBsAg (乙肝病毒表面抗原)、HBcAg (乙肝病毒核心抗原)、HPVL1或HPVL2等作为抗原表位的递送系统，可实现目标抗原的有效释放，体内诱导有效的免疫保护效应。研究表明：HPV6bL1为载体，携带与鼻咽癌发生发展密切相关的EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2 (LMP2)的T、B细胞优势多表位，实验动物体内显示了较好的免疫学效应[11]；HBcAg为载体携带E型沙眼衣原体Chlamydia trachoma主要外膜蛋白(MOMP)优势多表位免疫实验动物后，能够对衣原体的攻击产生免疫保护作用[12]。

无论哪个型别的HPV，其L1或L2体内外均可自行组装成病毒样颗粒的形式，作为免疫原或外源抗原的载体都是理想的选择。Slupettzky等证实了将外源表位插入至HPVL1衣壳蛋白表面是切实可行的，不影响L1的抗原特性[13]；HPVL1或HPVL2与其他抗原分子融合，还可实现共免疫反应，例如，羧基末端截短的HPV16L1蛋白融合到HPV16-E7蛋白(早期蛋白7)的氨基末端的融合体重组表达可自行组装成嵌合的病毒样颗粒(CVLP)，体内可诱导出分别针对L1和E7的特异性细胞毒性T淋巴细胞以及相应的特异性抗体[14]。

弓形虫T. gondii具有着复杂多期的生活史[15-17]，其主要外膜蛋白SAG1和棒状体蛋白ROP2与弓形虫感染的发生与进展密切相关，研究显示：SAG1具有诱导中和抗体的抗原表位，ROP2包含多个T细胞表位，可被体内具有高水平IFN-γ的免疫个体的淋巴细胞所识别[18]。我们前期制备了融合抗原ROP2-SAG1，证实体内外免疫学效应后，为提高免疫反应的特异性，又进一步筛选和确定了ROP2-SAG1免疫优势T、B细胞表位的组合，体内外同样显示了有效的免疫学效应[1, 9]。

HPV和T. gondii具有相同的免疫保护人群，以HPV16L1为载体携带T. gondii可实现共免疫效果，是比较理想的弓形虫免疫防治策略。本研究选择了HPV16型L1 (HPV16L1)为RSepitope递送载体，构建了两种形式的融合体RSepitope- HPV16L1和HPV16L1-RSepitope，而只有RSepitope- HPV16L1融合体体外能够实现共表达效应，而HPV16L1-RSepitope融合体体外细胞中既不转录也不能被翻译，说明表位和载体的融合位点导致序列的变化从而影响其后续生物学行为，其具体机制有待深入探讨。有文献也阐述了这个问题，即：外源表位插入至HPVL1特定区，产生的融合蛋白虽然能保留L1自行组装的能力，但过程很难预测，会受到插入表位的影响[19]。

本研究采用一种“DNA初免-蛋白质加强免疫”的方案检测融合体的体内免疫学效应。与体外结果一致，HPV16L1-RSepitope融合体在体内也不能诱导有效的免疫应答，虽然比较质粒对照组(pcDNA3.1)和PBS对照组，产生了低水平的体液和细胞免疫反应应该是由于最后一次RSepitope蛋白的加强免疫所致，HPV16L1-RSepitope的融合体形式体内外均不能正常表达，融合后的基因分析如何导致基因表达的调控需要后续研究进行解释。而RSepitope融合在HPV16L1“N”端的融合体(RSepitope-HPV16L1)，不仅在体外转染细胞中能够有效共表达(载体和表位均可正常转录和翻译)，而且实验动物体内也可诱导最为显著的体液和细胞免疫反应(即：产生了最高水平的RSepitope特异性抗体IgG和IFN-γ)，表现为Th1和Th2同时升高的免疫反应类型。而直接表位蛋白RSepitope免疫组(Group 4，蛋白免疫对照)仅诱导了显著升高的抗体水平，由于缺乏DNA免疫导致IFN-γ产生量明显缺乏，表现为偏向Th2免疫反应类型。研究结果证实：“DNA初免-蛋白质加强免疫”是比较理想的免疫方案，通过DNA免疫诱导细胞免疫可以清除感染细胞，再通过蛋白加强免疫诱导有效的抗体从而识别和结合游离细胞外的病原体，这种免疫方案更适合针对胞内寄生病原体，比如，弓形虫感染的免疫防治。另外，融合体RSepitope-HPV16L1组的免疫效应(体液和细胞免疫)也明显高于单独表位RSepitope组(Group 1，即：没有与HPV16L1融合)，证实了HPV16L1载体的优势效应。

因此，优势表位RSepitope融合在HPV16L1“N”端的融合体RSepitope-HPV16L1诱导了既有Th1也有Th2型免疫反应，且HPV16L1作为表位运载体系的免疫增强效应也尤为显著。本研究优化了一种合理的表位与载体的融合形式，为后续进一步分析RSepitope-HPV16L1体内的免疫保护效应，以及阐述表位与载体融合形式不同导致生物学效应显著差异的具体机制研究奠定了前期工作基础。