叶绿体(chloroplast) 是含有叶绿素(chlorophyll) 的质体，是绿色植物光合作用的基本功能单位，是有机物合成的生物工厂，也是植物激素与活性氧(reactive oxygen species, ROS) 生物合成的重要场所，参与调节植物的生长发育、抗逆应答、寄主-病原互作等[1-2]。叶绿体是一个半自主的细胞器，受核基因组与自身基因组两套遗传信息系统的控制，细胞核对叶绿体发育、维持、降解起了主导作用，而叶绿体也能发出逆向信号向细胞核反馈信息，两类机制相互协调，共同促成叶绿体的最佳发育及各项功能的发挥[3]。叶绿体的分子机理非常复杂，目前尚不完全清楚。1926年，Jenkins[4]在玉米中发现了一个叶绿体结构异常的叶色黄化突变体Golden 2。70多年后，Hall等[5]克隆了玉米Golden 2基因(简称ZmG2)，发现其编码蛋白是一类新型的转录因子。随后，玉米ZmG2的同源基因ZmGLK1 (Golden 2-like 1) 被克隆[6]，苔藓[7]、拟南芥[8]、水稻[9]、番茄[10]、辣椒[11]、花生[12]和油菜[13]等多种植物的GLKs基因也相继被报道(表 1)，为研究叶绿体的分子机理开启了一条新的途径。

目前，研究表明GLKs基因只存在于陆地植物中[26]，二倍体植物基因组中普遍存在两个直系同源的GLKs基因，其编码蛋白属于Myb类的GARP超家族成员，均包含一个DBD (DNA-binding domain) 结构域和一个特有的GCT-box结构域[27]。进化系统树分析显示，单子叶、双子叶和苔藓各自拥有独立的GLKs进化分支，表明GLKs基因在陆地植物分化之前就已经存在(图 1)。大量的遗传、分子、生理生化研究证明GLKs基因是调控植物叶绿体发育及其机能维持的关键转录因子，已成为植物光合机理研究领域的“明星”基因。最新研究发现，借助生物技术利用C4植物的GLKs基因可以改造C3作物的光合能力，使重要粮食作物水稻的光合效率显著增加，增产率最高可达70%[14, 28-29]，在作物高产育种中体现了巨大的应用价值。不仅如此，近年来GLKs基因还被报道参与了果实营养物质的积累、叶片衰老及逆境胁迫应答等多个途径(表 1)，很可能是植物细胞网络信号的关键节点，因此解析GLKs分子机理具有重要的研究意义，也有助于更好地指导作物光合能力提升的实践应用。目前，对GLKs基因研究进展的综述已有零星报道[27, 30]，但是对其调控分子机理的阐述不够深入。本文基于国内外的GLKs研究及其最新进展，重点介绍了GLKs基因发挥不同生物学功能的分子机理，构建了GLKs介导的信号网络模型，为GLKs机理的深入研究及其在提升作物光合作用中的应用提供借鉴。

植物GLKs基因在绿色组织中表达，如拟南芥、水稻、玉米的GLKs基因都在叶中高表达，在茎、花(穗) 中低表达，在根中不表达[6, 14, 31]，说明GLKs主要就是参与光合作用相关基因PhANGs (photosynthesis-associated nuclear genes) 的表达调控。对双子叶模式植物拟南芥研究发现，atglk1或atglk2突变体的表型与野生型没有差异，只有atglk1/atglk2双突变体才表现出叶片黄化、叶绿素含量下降、叶绿体变小且类囊体基粒减少，而在atglk1/atglk2双突变体中表达AtGLK1或AtGLK2基因都可恢复其突变表型[31-32]。有趣的是，单子叶模式植物水稻的OsGLKs基因也存在功能冗余，osglk1或osglk2突变体均无表型变化，osglk1/osglk2双突变体则表现出与atglk1/atglk2双突变体相似的表型[26]，说明植物的GLKs基因在调控叶绿体发育中普遍存在功能冗余的现象。过表达GLKs基因可导致转基因植株的叶片等光合组织更绿，甚至还能使非光合组织(如根) 形成具有功能的叶绿体[18]，表明GLKs是控制叶绿体发育和形成的重要因子。

进一步研究发现，GLKs也是调控C4植物叶绿体分化的关键因子。C3植物只有一种类型的叶绿体，而C4植物具有两种不同类型的叶绿体：叶肉细胞的有基粒叶绿体和维管束鞘细胞的缺乏基粒叶绿体。叶肉细胞将CO2转化成C4化合物，转运到维管束鞘细胞中进行卡尔文循环，其光合效率大大高于C3植物[33]。GLKs基因在C4植物的不同光合类型的细胞中表达具有明显的特异性，如玉米ZmGLK1基因、高粱SbGLK1基因在叶肉细胞中高表达，而玉米ZmG2基因、高粱SbGLK2基因则在C4植物维管束鞘细胞中高表达[14, 26, 34]。与水稻、拟南芥等C3植物不同，玉米zmg2突变体就出现叶色黄化、叶绿体发育异常，而且只影响维管束鞘细胞的叶绿体发育[6]。因此，植物GLKs基因既是叶绿体发育的普遍调节因子，又是叶绿体分化的特异调节因子[6]，也有学者认为GLKs基因的功能分化可能是C4植物进化的先决条件[26]。

GLKs是植物细胞核主导叶绿体发育的正向调控转录因子，主要转录激活两类PhANGs基因的表达(图 2、3)：一类是编码叶绿素生物合成的一系列关键酶，包括HEMA1、GUN4、CHLH、CHL27、POR和CAO等；另一类是编码光系统Ⅰ、光系统Ⅱ、光电子传递复合体的各类亚基[8-9, 26-27]。Waters等[8]证实了AtGLKs可以直接与靶基因启动子中的CCAATC序列和CACGTG (G-box) 序列结合。此外，GLKs还参与叶绿体-核逆向信号的反馈调节。研究表明，当质体受损或生物合成减弱时会引发大量PhANGs基因表达下降[35]，这很可能与GLKs的功能有关。因为用损伤叶绿体药剂(norflurazon) 或光合抑制剂(lincomycin) 处理拟南芥后，诱发质体损伤的信号会抑制AtGLK1基因的表达，而且依赖一个定位于叶绿体的逆信号蛋白GUN1 (genomes uncoupled 1)，因为在gun1突变体中AtGLK1基因的表达不受质体信号的影响[8, 36-37]。进一步研究发现，在质体损伤处理的gun1突变体中，尽管AtGLK1基因的mRNA水平没有下调，但是AtGLK1蛋白水平却显著下降了，表明质体信号也可通过不依赖GUN1的方式直接调节AtGLK1的蛋白水平，并且蛋白酶体抑制剂MG-32处理可以导致AtGLK1蛋白积累、且能部分互补由质体损失引发的AtGLK1蛋白下降，说明泛素-蛋白酶体系统参与了质体信号对AtGLK1的降解[38]。在番茄中，SlGLK2与CUL4互作，是CUL4-DDB1-DET泛素连接酶复合体的底物，CUL4、DDB1或DET1基因突变都会减缓26S蛋白酶体对SlGLK2的降解[39]。

许多植物的果实在未成熟前呈现绿色，叶绿体的数目和光合活性影响了果实的营养成分和风味[40]，而GLKs基因在期间发挥了重要作用。番茄SlGLK1基因在叶片中高表达，而SlGLK2基因在果实中高表达；有趣的是，SlGLK2基因在果实顶端的表达量最高，随纬度梯度呈下降趋势，果实底部的表达量最低，果实表皮的绿色程度与SlGLK2基因表达量呈明显正相关，出现典型的“绿肩”表型[10, 21]，从而影响果实成熟的均一性和品质。辣椒CaGLK1、CaGLK2基因的表达模式与番茄SlGLK1、SlGLK2基因的表达模式也非常类似[11]。这种组织表达的差异可能与基因启动子区域的组蛋白甲基化有关，因为只在SlGLK1基因启动子区域存在H3K4me3修饰，而在SlGLK2基因的启动子位置则没有发现[21]。番茄slglk1突变体的果实无表型变化，而slglk2突变体的果实为淡绿色且“绿肩”消失，因此SlGLK2基因也称Uniform (简称U)[21]；过表达SlGLK1或SlGLK2基因的番茄果实则整个深绿、叶绿体数目增加一倍多，绿色果实中更多、更大的叶绿体提高了淀粉、糖等光合产物[10, 21]，同时绿果中积累的叶绿素也为果实成熟后类胡萝卜素等合成提供了更多的前体，进一步提高了果实营养和品质[41]。异位表达猕猴桃的AchGLK基因也能提高番茄果实的叶绿体数目和营养物质[42]。在红椒中过表达CaGLK2基因能使绿果的叶绿素、红果的类胡萝卜素等含量都显著提高[11]。

在番茄SlGLKs信号途径的研究中发现，生长素(indole-3-acetic acid, IAA) 可直接抑制SlGLK2基因的表达，在不响应IAA信号的dgt突变体中SlGLK2基因表达不受IAA抑制[43]。ARF (auxin responsive factor) 是植物响应IAA信号途径的关键转录因子[44]，其中SlARF4和SlARF10分别对SlGLKs基因的转录起抑制和激活的作用[45]。SlGLK1基因启动子序列中含有ARFs的结合元件，ARF10能直接结合SlGLK1基因启动子转录激活其表达[45-46]。抑制SlARF4基因表达或过表达SlARF10转基因番茄的果实都为深绿色，但是前者深绿的表型仅限于未成熟果实，而后者深绿的表型在果实和叶片中都有出现，表明SlARF4与SlARF10基因功能的发挥具有一定的组织特异性[45-46]。此外，KNOX (knotted1-like homeobox) 型转录因子TKN2、TKN4也正调控SlGLK2基因表达[22]。

植物衰老早期的特征是叶片开始退绿、光合作用效率显著下降[47]，而叶绿体维持机能的丧失和叶绿素含量下降是其主要原因[48]。拟南芥atglk1/atglk2双突变体除了植株黄化，还出现叶片早衰的表型，而AtGLK1或AtGLK2基因过表达植株的表型则恰好相反[8]。在atglk1/atglk2双突变体中过表达AtGLK1或AtGLK2基因可互补其早衰表型[32]。可见，GLKs基因的功能也涉及了植物衰老，并受到光、脱落酸(abscisic acid, ABA)、油菜素内酯(brassinolide, BR) 等信号途径的调控。光是叶绿体发育所必备的条件，也与植物衰老密切相关，AtGLKs基因的表达也受光诱导[31]。光敏色素(phytochrome, phyA/B) 是植物感受光信号的重要受体，光敏色素结合蛋白PIF (phytochrome interacting proteins) 可激活由年龄触发或黑暗诱导的叶片衰老[49]。研究发现，PIF4是AtGLKs基因的转录抑制子，可直接结合AtGLKs基因启动子从而抑制其表达[50]。在光照条件下，光受体phyB被激活后，从细胞质进入细胞核与PIFs结合，引起PIFs的泛素化蛋白酶解，使得AtGLKs基因正常表达，叶绿体的机能得以维持；在黑暗条件下，由于PIFs蛋白积累，抑制了AtGLKs基因及其下游PhANGs基因的转录，导致叶绿体的机能丧失，引发叶片衰老[51-52]。

ABA也是诱发植物衰老的重要激素，ABA可促进NAC类转录因子ATAF1 (Arabidopsis thaliana activating factor 1) 直接抑制AtGLKs基因的转录；同时ATAF1激活其靶基因ORE1 (oresara 1) 的表达，而ORE1与AtGLKs蛋白互作，进一步下调AtGLKs的转录活性，最终抑制PhANGs表达，从而促进叶片衰老[19, 53]。最新研究发现，拟南芥的WRKY75与SIB1 (sigma factor binding protein 1)、SIB2基因的表达都受ABA与叶片衰老的诱导，WRKY75作为转录因子可结合AtGLKs基因的启动子抑制其转录，促进叶片衰老[54]；而SIB1与SIB2是叶绿体基因组编码的质体RNA聚合酶SIGs (sigma factors) 的互作蛋白，同时含有叶绿体定位信号和核定位信号，也是叶绿体-核逆信号的关键因子[55]，SIB1或SIB2都能与WRKY75发生蛋白互作，解除WRKY75对AtGLKs基因的转录抑制，AtGLKs基因的表达在sib1、sib2突变体中均显著下调，而在SIB1过表达株系中则刚好相反，证明了ABA通过WRKY75与SIB1 (或SIB2) 正、负调控AtGLKs基因的表达来调节叶片衰老[54]。此外，AtGLKs基因的表达还受BR信号转导途径的BZR1和BZR2抑制[50, 56]。

病原菌侵染植物时，叶绿体能感知并迅速地将信号传递给细胞核，促使植物建立免疫防御体系，而GLKs可能在其中起了重要作用。在拟南芥中，过表达AtGLK1基因能增强植株对真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)[20, 57]、灰霉病菌(Botrytis cinerea) 的抗性[16]，一些基础防御的基因表达显著上调[20]；而异位表达花生AhGLK1b基因的拟南芥对细菌Pst DC3000和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 也表现出较强的抗性[12]。atglk1atglk2双突变体则更易感染黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)，且受损更严重，PR1、PR2、THI2.1、PDF1.2等水杨酸(salicylic acid, SA) 与茉莉酸(jasmonic acid, JA) 途径中的基因也被显著下调[58]。芜菁花叶病毒(turnip yellow mosaic virus) 的毒力蛋白P69能够与AtGLKs发生蛋白互作，并抑制其对PhANGs基因的转录激活，导致植物出现淡绿色表型，影响植株正常生长[59]。在烟草中，NbGLK1能与病毒免疫关键因子Rx1结合并启动免疫反应[23]。研究表明，GLKs参与植物的抗病反应很可能与SA信号途径有关。SA受体蛋白NPR1 (nonexpresser of PR genes 1) 可诱导SIB1的表达启动防御应答，sib1突变体对灰霉病菌的抗性减弱，但过表达SIB1转基因植株则抗性增强[60]。SIB1在细胞核能与GLKs蛋白互作，增强GLKs对核基因PhANGs的表达，同时SIB1也能进入叶绿体与SIG1互作，抑制质体基因PhAPGs (photosynthesis-associated plastid genes) 的表达，核-质体的光合相关基因不协调表达，会引发光系统Ⅱ的光抑制效应，导致叶绿体积累ROS (reactive oxygen species) 单线态氧(1O2)，而1O2能被叶绿体定位蛋白EX1 (executer 1) 感知，并产生质体-核逆信号转导，引发PCD (program cell death) 而启动防御反应[61]。另外，SA途径一个调控PCD的LSD1 (lesion-simulating disease 1) 蛋白也可结合GLKs，并且抑制GLKs与靶基因启动子的结合活性，使其转录活性下降，过表达LSD1基因可抑制PhANGs基因表达和叶绿体发育，而lsd1突变体则会增强这些基因的表达和抗病性[62]。SA诱导的SIB1蛋白则能扰乱LSD1-GLKs的互作，竞争性结合GLKs，表明SIB1和LSD1蛋白在GLKs活性调控方面存在拮抗作用，通过叶绿体精细调节ROS的产生，参与防御应答[61-62]。

此外，GLKs还参与了植物耐寒、抗旱、耐臭氧等非生物胁迫的调控。在拟南芥中，过表达棉花GhGLK1基因显著提高了植株对干旱、低温的抗性[63]；在atglk1/atglk2双突变体中异位表达花生AhGLK1基因，能使植株在干旱恢复过程中PhANGs基因表达显著上调，促进叶绿素的生物合成和光合作用，帮助植株恢复正常的生长水平[15]。另有研究表明，GLKs可通过控制气孔开闭调节植物对臭氧的耐受性[17]，在功能缺陷的拟南芥GLK1/2-SRDX突变体中出现气孔关闭表型和很强的臭氧耐受性，而过表达AtGLK1或AtGLK2基因植株则出现气孔开放和对臭氧的更高敏感等表型；GLK1-SRDX植株中K+通道活性降低，造成气孔关闭，从而应对臭氧胁迫。

提高植物绿色组织的光合效率是增加作物产量的有效手段[64]。由于C4植物的光合细胞具有高光合效率的特点，学者们试图利用C4植物的GLKs基因在C3植株中构建C4途径，以提高C3植物的光合能力。Wang等[26]在水稻中过表达玉米ZmGLKs基因可使其叶肉细胞的叶绿体增大、维管束鞘细胞的叶绿体发育，在叶片结构层面上完成了由C3向C4转化的第一步[28]；Li等[29]进一步证明，过表达ZmGLK1或ZmG2基因的水稻植株由于叶绿素和色素蛋白质天线复合体水平的增加从而提高了捕光效率，而叶黄素水平的增加则缓冲了在强光或波动光条件下光抑制的负面影响，整体光合能力的增强使转基因植株产生更多营养，其生物量和籽粒产量增加了30%−40%。Yeh等[14]发现，在水稻中不论是采用玉米GLKs基因的自身启动子还是组成型启动子驱动ZmGLK1或ZmG2基因的表达，转基因植株均能提高叶片的叶绿素含量、核酮糖二磷酸缩化酶(Rubisco) 的酶活性以及单位叶面积的光合速率，但是只有基因自身启动子(pZmG1:: ZmG1、pZmG2:: ZmG2、pZmG1:: ZmG1/pZmG2:: ZmG2) 的转基因植株提高了产量(51%、47%和70%)，研究者推测可能是由于高表达玉米ZmGLKs基因对水稻生长和种子发育存在负面影响。此外，异位表达GLKs基因可使非绿色器官产生有功能的叶绿体，增加了植株的光合面积，促进了植物对碳源的有效利用[18]，也可以作为一种高产育种的策略。

GLKs作为一类植物特有的转录因子，是叶绿体发育与分化、维持细胞光合机构所必需的，通过核-质体双向信号通路共调节核、质体光合基因的表达，以优化不同环境和发育条件下的光合能力，调节光合代谢、同化的产物，在果实营养物质的积累、叶片衰老、免疫反应及逆境胁迫应答等多途径中发挥其生物学功能，GLKs基因在转录水平、翻译水平和其编码蛋白的转录活性等多维度都受到正、负调控，涉及各类蛋白因子、植物激素和环境因子等等，其分子机理相当复杂。基于已有的研究结果，我们构建了一个植物GLKs的调控分子机理及其信号网络模式图(图 4)，可见在各路信号途径中GLKs主要受负调控，我们从水稻中也鉴定到了两个负调控GLKs介导叶绿体发育的未知功能小肽NRPC1 (negative regulator of photosynthesis and chloroplast development 1) 和NRPC2[65]，目前NRPCs-GLKs的分子作用机理还在研究中。推测GLKs可能是植物细胞保持核PhANGs基因与质体PhAPGs基因的表达平衡、维持光合作用稳态的关键；这种平衡一旦被打破，可能就会导致细胞紊乱或坏死[62-63]，其中质体-核逆信号可能是引发负调控的关键，但是其分子机理还不是很清楚。目前认为GLKs作为转录因子，其转录调控的靶基因主要是PhANGs，这些基因编码叶绿素生物合成、光合系统复合体的亚基、质体发育因子等的关键酶或重要组分，均与叶绿体和光合作用直接相关[7-8, 32]。但是GLKs涉及的生物学途径很广，也有可能直接调控其他类型的基因，如在防御应答中AtGLKs介导了JA信号途径的基因[16]，在ABA响应中AtGLKs可靶向WRKY40基因的启动子[66]，过表达AtGLK1基因可上调花青素生物合成的相关基因表达[67]，GLKs靶基因的进一步鉴定将有助于更全面地解析其分子机制。虽然C3和C4植物的GLKs在功能上存在明显的分化，但是从进化树分析中可以发现，C4植物GLKs没有独立的分支，而是与C3植物的GLK1、GLK2都存在同源直系基因(图 1)，有学者推测GLKs可能起源于单个基因，基因复制促使亚功能出现，进而在C4植物中促进双态叶绿体的发育[26]。GLKs机理的深入研究对揭示植物细胞信号网络具有重要的帮助，同时在提高作物产量的实践中可发挥巨大潜力，具有较好的应用前景。