李海燕，郭莹，李夏媛，李枝林

(云南农业大学花卉研究所，云南昆明 650201)

目前，兰花的育种仍是以杂交育种为主，随着生物技术的发展，多倍体育种具有其他育种方式不可代替的优势。将兰花远缘杂交育种与多倍体育种相结合，不仅可以克服远缘杂交不亲和性，而且可以育成观赏性状更好的兰花新品种。兰花是兰科植物(Orchidaceae)的总称，我国习惯上将兰花分为国兰和洋兰［1］。国兰主要指人们常说的春兰、蕙兰、建兰、寒兰、墨兰这5大类，因其株型秀丽、叶姿态飘逸、花色素雅、花香清幽而深受国人的喜爱;洋兰大多数是指那些花序大、花瓣平整宽大，花型丰满圆润、花色鲜艳的种类，如蝴蝶兰、石斛、兜兰、卡特兰、大花蕙兰等。国兰和洋兰各自具有良好的观赏性状，如何通过杂交育种方法，选择、选配父母本培育出受市场青睐的具有更多优良性状的兰花新品种，是国内外兰花育种工作者为之不懈奋斗的目标。笔者对用多倍体育种克服远缘杂交不亲和性，结合组织培养方法获得性状优良的兰花新品种的方法进行阐述，以期为今后兰花杂交育种提供依据。

我国栽培兰花的历史已有2 000多年，但是杂交育种工作开展却很少。在自然状态下兰花杂交仅限于属内，主要有以下原因:①许多兰花以特定的昆虫为其传粉;②不同种类兰花花期不同;③由于地理分布的阻碍及杂交不亲和性。在兰花远缘杂交工作中，若能解决远缘杂交不亲和性，那么通过人工授粉来进行兰花杂交育种则可使杂交后代出现的可能性大大增加。我国兰属植物的杂交育种起始较晚，在国际上登录的杂交种寥寥无几［2］。可能受传统文化的影响，要遵从万物自然生长的规律，不能人为干扰，所以长期以来几乎一直没有人用人工杂交育种来生产新的杂交品种。1992年，美国植物生理学家发现糖类能代替真菌提供兰花种子萌发所需的营养物质，在无菌条件下将兰花种子播种于含糖的培养基上就能正常萌发［3］。此后，兰花品种间、种间及属间的杂交育种得以开展。

据《国际散氏兰花种杂种登记目录》(Sarder’s List of Orchid Hybrids)记载，人工杂种约在4万种以上，而且还以每年1 000种以上的速度增加，仅远缘杂交就育成由7个属杂交产生的集体杂种［4］。张志胜等从1996年开始进行兰花远缘杂交的试验研究来改良墨兰的性状，兰属内杂交组合有下山墨兰 ×大花蕙兰(Cymbidium grandiflorium Ldl．)、寒兰 × 建兰、墨兰×建兰、企剑白墨×春兰;属间杂交组合有墨兰×文心兰(Oncidium flexuosum L．)和墨兰 × 蝴蝶兰［5］。曾宋军等用仙殿墨兰自交及其与象白牙或西藏虎头兰杂交，育成2个新品种，其花色美观，在生长势和抗逆性等方面均优于亲本，现已进行大规模推广［6］。麦奋用我国传统春兰品种‘翠盖’与垂花型杂交蕙兰成功培育出具有双亲半数特征的新品种［7］。李方等通过蕙兰×台兰种间杂交获得中间型开花的植株［8］。朱根发等曾报道获得了建兰×莲瓣兰(C．aloifolium)杂交后代［9］。李枝林等选择兰属、蝴蝶兰属、贝母兰属、鹤顶兰属、坛花兰属、兜兰属、槽舌兰属作为属间杂交亲本;以兰属的6个种碧玉兰、沉香虎头兰黄素、莲瓣兰和大雪兰作为种间杂交亲本，获得了一批杂交种子［10］。同时，对大花蕙兰×虎雪兰和春绿兰×虎雪兰的F1代进行多倍体诱导，获得了异源多倍体植株。

深受人们喜爱的红花系大花蕙兰均为杂交种，染色体倍性呈多样性，有二倍体、三倍体、四倍体、甚至六倍体，以它们作为亲本与其他兰花进行杂交，育成了多种在国际上获得奖项的新品种。近年来，美国、日本和新西兰等国的育种者将大花蕙兰与建兰、纹瓣兰等杂交，培育出了一些早花(秋冬开花)、微香、短叶型或垂花型大花蕙兰品种，很受市场欢迎［11］。

3．1 兰花杂交育种方法

3．1．1 建立兰花种质资源圃。我国野生兰花资源极其丰富，约有173属1 200多种兰花原生种。建立兰花种质资源圃，首先要对野生兰花的生境及种类进行调查，模拟兰花生境自然条件，尽可能搜集不同的兰花原生种进行试验种植，观察并记录它们的各个性状(如株高、叶型、花色、花香、花朵数量等)以及抗逆性、适应性、生育期、性状遗传规律、对环境条件的要求等，确定兰花杂交亲本组合亲本的选择。

3．1．2 亲本选择。良好的观赏性是进行兰花杂交育种的首要目标，其次是提高抗性。人们趋向于培育出花大色艳、有香味的新品种。可以结合国兰和洋兰各自的优点来进行亲本的选择，如国兰中的墨兰叶型漂亮、叶幅宽有光泽，但香味不足;蕙兰香气浓、抗逆性强，但开花时间晚且不易开花;建兰最易上花，香气也足，但开花时间短，集中在夏秋两季。大多数的洋兰品种虽花大、色艳，1个花序上着花较多，但无香味。在进行父母本选择时，针对已有的原种优缺点拟定合适的组合进行杂交。

3．2 多倍体诱导方法 人工诱导多倍体的途径主要有物理方法、化学方法和2n配子法。①物理方法主要是用温度骤变、机械创伤、电离射线和非电离射线处理等方法进行染色体加倍［12］。早期诱导多倍体大多采用摘心和高低温处理授粉后的幼胚等机械方法［13］。经过高温处理可以诱导杨树的二倍体花粉［14］，但总的来看温度骤变和机械创伤是染色体加倍的频率很低，而射线在使染色体加倍的同时又会引起基因突变，因此运用物理方法多不理想。②化学方法是利用一些化学诱变剂，如秋水仙素、萘嵌戊烷和富民农等。在兰花多倍体诱导过程中大多是用秋水仙素，一般浓度在0．01% ～1．00%，以0．20%最为常用。通常是诱导的方法有浸渍法、涂抹法、滴液法、套罩法、毛细管法和复合处理等方法。兰花多倍体的诱导大多采用浸渍法和混培法，将兰花的原球茎、丛生芽或幼苗浸泡在不同浓度的秋水仙素溶液中，然后转入培养基进行培养，或者将诱导材料接入含有不同浓度的秋水仙素溶液里培养。在用秋水仙素进行处理时，必须要注意药剂浓度、处理时间、细胞分裂时期和植物生长状况。孟英用浓度3%的秋水仙素处理大花蕙兰×虎雪兰的原球茎72 h，多倍体诱导率达30%。由于秋水仙素是一种较强的神经性毒剂，对人、畜危害极大。近年来，发现一些除草剂(如Oryzalin、Sufflan、Trifulan等)，这些药剂是一类安全、高效的植物染色体加倍剂，因为这些药剂对植物的微管蛋白的亲和性高，同时对动物蛋白的亲和性低［15］。其中，Oryzalin能阻止正在分裂中的细胞纺锤丝形成，在药效消失后细胞又恢复常态，重新分裂而形成多倍体，对植株的危害小，但目前在国内尚未见到使用Oryzalin诱导兰花多倍体的报道。③利用2n配子法获得多倍体。用秋水仙素等化学诱变剂诱导的多倍体只能将原有类型染色体数增加1倍，诱变后都是偶数倍的多倍体。通过有性杂交，亲本形成配子之前染色体数目不减半，而是形成2n配子，与正常配子受精可以产生同源多倍体，继而产生一系列非整倍体。Watanabe用抗病马铃薯2n配子与易感病的四倍体杂交，并获得了抗病的四倍体后代。同时，通过2n配子和正常二倍体杂交可以直接得到三倍体，而不需要四倍体亲本。在自然界多倍体形成的主要途径是利用2n配子，而目前在人工多倍体诱导中很少采用，现已较为深入地研究和应用2n雄配子，而2n雌配子相对较少。可以效仿天然多倍体的形成途径，利用2n配子进行生物多倍体育种，2n配子的杂合性和二倍性，使其在生物多倍体育种上极具意义，对2n配子产生条件和遗传控制机制进行深入研究，选择高产2n配子的生物个体应用到育种中，必将推动多倍体育种工作的发展［16］。

远缘杂交是获得新种的重要因素，利用远缘杂交方式可以将更多双亲的优良性状集中在杂交后代，获得的杂种后代通常具有杂种优势。但是，由于2个亲本的形态特征、遗传组成和细胞结构等方面不同常常导致杂种F1代细胞在减数分裂时不能进行正常联会而不育。通过对亲本之一进行染色体加倍成同源多倍体或者对杂交双亲同时加倍，来克服杂交不孕性。例如，二倍体甘蓝与白菜不易杂交成功，但四倍体甘蓝则能与之杂交。此外，也可以对F1代进行染色体组加倍，使其细胞在减数分裂时能正常联会，来克服远缘杂种的不育性。

在进行兰花新品种选育过程中，多倍体育种的意义还表现为通过染色体加倍的植物表现出的“巨大性”，可以培育出花朵大、花瓣多且厚、花色浓的兰花新品种。此外，多倍体兰花的植株粗壮、叶片宽阔浓绿，进一步提高兰花的观赏价值和商品价值［17］。多倍体植株对外界环境条件的适应性更强，抗旱、抗寒能力也进一步提高。也可以将多倍体作为基因转移的载体和基因渐渗的媒介作用，将野生种中的抗病基因转移到栽培种。

兰花杂交育种是一个系统的过程，周期长达7～8年，在制定育种目标时要判断在7～8年后是否能得到消费市场的认可;杂交后代性状分离，分离的后代中杂种类型较多，要注意筛选;杂交种子的无菌萌发是进行杂交育种的关键环节，要选择合适的培养基，同时注意激素的配比。在多倍体诱导过程中，往往会出现大量的嵌合体，由于兰花生长缓慢，对嵌合体的纯化非常困难;多倍体植株染色体数目增多，细胞分裂速度慢［18－19］，而且多倍体植株还存在组织培养中增殖率极低和花期延迟等问题需要解决;诱导兰花多倍体使用的秋水仙素等化学诱变剂对兰花都有不同程度毒害作用，处理浓度和时间不适宜会抑制植株生长，甚至会导致植株死亡。在自然界中的异源多倍体能较好地保持性状生存下来，而人工诱导的异源多倍体通常竞争不过正常二倍体或者又变回二倍体，因此异源多倍体的遗传机制还有待深入研究。

经过2个或2个以上物种的染色体经过重组后而形成的遗传稳定结构的个体叫做异源多倍体［20］。开展种属间杂交结合染色体加倍而形成的异源多倍体不仅可以克服远缘杂交的育种障碍，而且合成了一个新物种，在兰花新品种培育方面具有广阔的前景［21］。在异源多倍体中，杂合子往往还具有潜在的杂种优势。在水稻的研究中，远缘杂交和多倍体化相结合的育种技术不仅理论上已经完善，以野生稻为重点的稻属11个基因组图谱也在研究中［22－23］。然而，我国对兰花异源多倍体的系统研究尚未有报道。异源多倍体的基因表达的变化丰富了生物的多样性，常出现不同于其二倍体且不能用孟德尔定律解释的新表型［24－26］，这些变异为育种工作提供了丰富的资源，对品种改良具有重要意义。此外，异源多倍体在形成早期，基因组会经历一个较长时间的稳定性进化过程，亲本染色体间存在部分同源性会引起亲本染色体组间发生广泛的重组交换［27］，从而使异源多倍体不同世代产生的配子间出现差异。因此，在利用远缘杂交与多倍体育种时还应充分考虑和研究不同世代的利用效果。我国目前虽有育成异源多倍体兰花植株，但关于异源多倍体兰花的性状、基因表达模式及其原因还未见报道，这将是今后在进行兰花新品种选育过程中的主要研究方向之一。

在保护的前提下，充分利用野生兰花资源，克服兰花杂交育种过程中遇到的种种技术难题，将兰花远缘杂交与多倍体育种相结合将是今后兰花育种的热点之一。将兰花常规杂交育种方法和诱变育种、基因工程相结合，以组织培养为手段，培育出观赏性好、抗性强的兰花新品种，满足市场的需求，必将使我国兰花在竞争激烈的国际市场中立于不败之地。

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安徽农业科学2015年14期