杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种致死性的X连锁隐性遗传性疾病，由基因Dystrophin突变所致，男性活婴的发病率为1/3 500[1]。该病是儿童期最常见的肌肉病，一般3~5岁隐匿发病，9~12岁丧失站立和行走能力，多于20岁左右因心、肺功能衰竭而死亡[2]。Dystrophin基因是人体最大的基因之一，突变类型复杂多样，包含外显子（大片段）缺失/重复、单碱基点突变、微小缺失/插入、少量复杂突变和内含子突变等，导致DMD患者的基因诊断方法很难统一[3-4]。以往常用的分子诊断方法有：多重连接探针扩增术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）、基因芯片、多重聚合酶链反应、逆转录PCR、短串联重复序列连锁分析、荧光原位杂交及引物原位标记技术等，各有优缺点，单选一种技术方法常会存在漏检发生[5]。目前，二代测序（next-generation sequencing, NGS）技术是唯一可以同时检测所有突变类型的平台[6]。刘敏娟等[7]于2012年初步探讨了NGS对DMD患者基因检测临床应用的可行性，6例患者成功检测到Dystrophin基因点突变、缺失和重复，但该技术尚未广泛应用于DMD的基因诊断。本研究中22例先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel和Dystrophin基因的MLPA检测，比较分析两种方法检出的Dystrophin基因外显子缺失/重复结果，采用Sanger测序验证Dystrophin基因点突变，旨在进一步分析NGS技术在DMD基因诊断中的临床应用价值。

2017年5月至2018年7月郑州大学第一附属医院儿科门诊就诊的22例临床拟诊断为DMD的男性患儿纳入研究。年龄50 d至11岁，均无神经肌肉病及其他遗传性疾病家族史。其中，因发现血清肌酶升高就诊4例；双下肢肌无力，行走姿势或步态异常，走路、跑步易摔倒就诊9例；行走费力、上楼和蹲下立起困难或不能就诊8例；另有1例因运动及智力发育落后，先不会爬、后不能独立站立就诊。22例患儿家属均同意行致病基因检测并签署了知情同意书。本研究已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。

抽取患儿及其父母、兄弟姐妹外周血各2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，冷链运送至武汉康圣达医学检验所有限公司，按照标准流程提取基因组DNA。

选择遗传性神经肌肉病相关panel（检测基因594个）检测。采用安捷伦SureSelect Human All Exon V6定制试剂盒进行全部外显子区域及外显子-内含子交界处DNA捕获并富集，Illumina HiSeq平台进行测序。测序片段通过Burrows-Wheeler Aligner（BWA）软件（版本：0.7.9a）和UCSChg19人类参考基因组进行比对，比对结果采用Picard（版本：1.115）软件去除重复序列。

采用Genome Analysis Tool Kit（GATK，v3.2）软件进行变异检测，包括碱基质量分数校正，InDels位置和质量分数校正，SNVs和InDels变异发现和分型[8-9]。基于同批次一致性背景库和bed区域的测序深度计算基因外显子的拷贝数变异（copy number variation, CNV）[10-11]。CNV分析主要分两步：一是计算每个测序目标的测序深度，在每个样本中，剔除所有中位测序深度 < 20或 > 4 000、长度 < 20 bp或 > 2 000 bp、映射系数 < 0.9、GC含量 < 20%或 > 80%的区域，采用k=5的k均值聚类算法创建一个参考集；二是均一化和CNV分析，采用默认参数的CNVkit工具对测序数据深度均一化和CNV分析，在均一化阶段，利用参考集去除系统误差和偏差，提高信噪比。

运用基因检测智能操作系统（Genetic Testing Intelligent Execution System）进行变异注释，SNPEFF软件（hg19, GRCh37）进行变异解读，其中功能性的编码区和剪切位点的变异将进入下一步分析。通过ClinVar、在线人类孟德尔遗传（On-line Mendelian Inheritance in Man, OMIM）和人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database, HGMD）等查找变异位点或疑似致病突变的收录情况，进行基因突变致病的分析等。

采用SALSAP034和P035（MRC-Holland，荷兰）试剂盒，按照说明书步骤，将变性后基因组DNA与SALSA MLPA探针杂交18 h，加入连接酶和缓冲液进行连接反应，经PCR扩增后用ABI3500XL基因分析仪（Applied Biosystems, 美国）分析，所得数据用Gene Marker v2.2.0软件分析。每次检测都包括2个健康对照样本，通过计算健康对照人群平均扩增峰值，对所扩增峰值进行标准化处理，分析得出MLPA分析结果图。

通过NGS检测出先证者为基因点突变及微小缺失时，先证者及家属选择PCR扩增Sanger测序验证。根据NGS分析结果，使用NCBI中Primer-BLAST在线软件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计目标区域的扩增引物。以家系成员DNA为模板，使用TaqDNA聚合酶扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化的PCR产物在全自动测序仪ABI377（Applied Biosystems, 美国）上进行双向测序，测序结果用Chromas（version2.23）软件分析，并在NCBI中与正常序列（NM_004006.2）比对分析。

通过NGS测序，22例先证者均检出Dystrophin基因变异，检出率为100%：外显子（大片段）缺失突变13例（59%），外显子（大片段）重复突变1例（5%），无义突变2例（9%），错义突变1例（5%），微小缺失4例（18%），内含子突变1例（5%）（图 1）。患者均为半合子突变。通过在HGMD检索，本研究检测出的14例Dystrophin基因外显子（大片段）缺失/重复均已收录，1例无义突变c.10171C > T（p.Arg3391Stop）和1例内含子突变c.31+36947G > A已收录；1例错义突变c.6290G > T（p.Gly2097Val），1例无义突变c.3487C > T（p.Gln1163Stop），4例微小缺失导致的移码突变c.1208delG（p.Gly403fs）、c.7497_7506delGGTGGGTGAC（p.Met2499fs）、c.9421_9422delAA（p.Asn3141fs）、c.8910_8913delTCTC（p.Ser2970fs）在HGMD均未见报道，为新突变。SIFT软件和PolyPhen软件对c.6290G > T错义突变致病性评估分别为：SIFT预测为有害，PolyPhen预测为可能有害，综合分析该错义突变可能产生基因损伤效应，有致病性可能。

22例先证者通过MLPA检测，检出13例外显子缺失突变，1例外显子重复突变，检测结果与NGS测序结果完全一致。8例先证者母亲进行验证，2例为杂合突变携带者，6例为野生型（表 1）。

8例先证者Dystrophin基因点突变经PCR扩增Sanger测序验证均为阳性，证实NGS检测结果是准确的。8例先证者母亲进行验证，7例为杂合突变携带者，1例为野生型；2例先证者姐姐及1例先证者妹妹为杂合突变携带者；1例先证者弟弟为半合子突变（表 1）。

DMD是由位于Xp21.2的基因Dystrophin缺陷所致，是一种严重的、致死性神经肌肉病，患者多在20岁左右死于心、肺等功能衰竭。然而，本病迄今为止仍缺乏有效的治疗方法[1-2]，高效、准确的基因诊断和携带者筛查是有效降低DMD携带者患儿出生的关键。目前，临床上常见的DMD基因诊断方法是采用MLPA方法检测[12]，检测结果阴性患者再选择NGS检测点突变和其他微小变异[13]。本研究中，22例疑似DMD先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel进行NGS检测和Dystrophin基因MLPA检测，检测结果证实NGS检出的Dystrophin基因外显子缺失和重复与MLPA检测结果完全一致，点突变/微小缺失经Sanger测序验证结果准确无误，进一步说明NGS技术是可以全面检测复杂突变类型的Dystrophin基因变异，可在临床中广泛推广和应用。

DMD患儿在婴幼儿期的临床表型难以与其他肌营养不良区分，如强直性肌营养不良、肢带型肌营养不良等。针对婴幼儿期的患者，如果直接选择MLPA方法检测Dystrophin基因外显子缺失/重复，存在漏检点突变和微小变异的可能，也存在漏检其他肌营养不良疾病的可能。因此，本研究选择遗传性神经肌肉病相关panel进行NGS检测致病基因，虽未检测到其他致病基因的突变，但22例先证者的阳性率为100%，检出8例Dystrophin基因点突变/微小变异，14例Dystrophin基因大片段缺失/重复。

DMD患者中大约70%是由Dystrophin基因外显子缺失/重复造成，其余由Dystrophin基因点突变（无义/错误）、微小缺失/插入导致[3-4]。王凤羽等[14]和王军等[15]报道的MLPA检测DMD患者的阳性率均在72%左右，其他患者临床未确诊。为了避免漏检，白莹等[13]报道的研究中，先采用MLPA检测先证者外显子缺失/重复，对MLPA检测阴性的先证者应用NGS检测点突变情况，应用PCR扩增Sanger测序对点突变验证。该研究时间为2010年3月至2014年12月，此期间应用NGS检测DMD患者的基因变异情况是昂贵的，所以推荐的DMD基因诊断流程是以MLPA方法为基础。随着NGS测序成本的逐年下降，临床接受度提高。本研究中22例先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel和Dystrophin基因MLPA检测，NGS检测出的Dystrophin基因外显子缺失、外显子重复、微小缺失、单碱基点突变和内含子突变的比例分别为59%、5%、18%、14%和5%，与已报道文献结果一致[16-17]，经MLPA和Sanger家系验证分析，无假阳性和假阴性结果存在。本研究中，NGS检测的外显子拷贝数变异是基于同批次一致性背景库和bed区域的测序深度计算的，与MLPA检测结果一致。本研究检测出Dystrophin基因内含子突变1例c.31+36947G > A，属于外显子-内含子交界处，NGS技术也会漏检部分内含子突变，采用全基因组测序则可避免，但费用昂贵，难以在临床应用。

本研究通过对先证者母亲进行携带筛查发现，Dystrophin基因新发突变率高达44%（7/16）。有研究报道，对于新发突变DMD患者的母亲，外周血没有检测出为携带者的不能排除存在生殖嵌合体，建议对其再生育胎儿进行产前基因诊断[13]。鉴于Dystrophin基因新发突变率和突变特点，推荐选择NGS进行Dystrophin基因产前诊断。

本研究22例先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel和Dystrophin基因的MLPA检测，结果显示NGS技术在Dystrophin基因诊断中的临床应用是值得推广的。NGS测序应用于Dystrophin基因产前诊断有一定临床应用价值，但尚需进行大样本量Dystrophin基因突变分析。本研究中发现的6例新突变丰富了Dystrophin基因突变谱。